Ce travail a été soutenu par le NIH subvention DP2OD008470.

Les procédures pour travailler avec des embryons de poisson zèbre décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l&#39;utilisation institutionnelle à l&#39;Université de Notre Dame. Préparation de la solution de Ringer 1. <ol><li> Faire une solution de NaCl 116 mM, 2,9 mM de KCl, 3,6 mM CaCl 2, et 5 mM Hepes avec ultrapure H 2 O par agitation continuelle pour éviter toute précipitation de sel. </li><li> Après addition de sels et tandis que la solution est toujours sous agitation, ajouter 100 unités / ml de pénicilline et par 100 ug de streptomycine par ml. </li><li> Après l&#39;ajout de tous les antibiotiques et des sels, effectuez filtre stérilisation de la solution et de stocker dans le récipient stérile. Remarque: N-phénylthiourée (1-phényl-2-thiourée) ou PTU peuvent être ajoutés à la solution de Ringer pour bloquer la formation de pigment dans bourrelet embryons implantés sans conséquences négatives pour la santé de l&#39;embryon. Pour préparer la solution de blocage / de la pigmentation de Ringer, utiliser un concentration de 0,003% PTU. En raison de la faible concentration de PTU à ajouter, il est conseillé que le plus grand volume de la solution de Ringer être faite, au moins 1 L, pour éviter d&#39;ajouter de quantités infimes de poudre PTU. Ajouter PTU lors de l&#39;étape 1.2, tandis que la solution est bluffante. </li></ol> 2. Préparation de la solution Tricaine <ol><li> Ajouter 2 g de 3-aminobenzoate méthanesulfonate (Tricaine) par litre de solution plus 0,1 M Tris, à partir d&#39;un 1 M de stock équilibrée à un pH de 9,5 et fait avec ultrapure H 2 O. Remarque: Tricaine sera utilisé pour euthanasier les embryons de poisson zèbre au point de temps désiré pour doser perles phénotypes d&#39;implantation. </li></ol> 3. Préparation de la solution E3 <ol><li> Ajouter une solution de 0,25 M de NaCl, 10 mM de KCl, 12,5 mM de CaCl2, et 16,6 mM de MgSO 4 à 1 L d&#39;eau ultrapure pour créer une L de E3. </li><li> Ajouter 200 pi de bleu de méthylène à la solution E3 pour inhiber la croissance fongique. </li></ol>4. Tirer Aiguilles pour le transfert Microbead <ol><li> Utilisez le feu poli verre borosilicate avec filament à une DO: 1,0 mm, ID: 0,5 mm, d&#39;une longueur de 10 cm. </li><li> Placez le verre borosilicaté dans un extracteur micropipette pour préparer de fines aiguilles. Remarque: Les quatre dimensions suivantes peuvent être utilisées comme un point de départ pour tirer les aiguilles: Chaleur = 540, Pull = 245, Velocity = 200, et de l&#39;heure = 125. </li><li> Après avoir tiré un nombre suffisant d&#39;aiguilles, magasin en plastique couverte boîtes de Pétri, positionnés sur des bandes de pâte à modeler ou de ruban adhésif pour éviter la rupture de la pointe de l&#39;aiguille, jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Pour couper la pointe de l&#39;aiguille de la taille d&#39;alésage souhaité, utiliser une paire de pinces fines pour marquer la fin de l&#39;aiguille. Remarque: la taille de l&#39;alésage d&#39;aiguille varie en fonction de la taille de la microbille étant utilisé ainsi que les préférences de manipulation de l&#39;utilisateur. Un bon point de départ est de taille artisanale de forage dans une fourchette comprise entre 100 et 200 um si microbilles allant de 50 à 100 um seront utilisés. </li><li> Prior à utiliser, insérer l&#39;aiguille taillée dans le support de tube capillaire à la mode l&#39;instrument de transfert de microbilles terminée. </li></ol> 5. Moustaches / Lash outil de préparation <ol><li> Obtenir une moustache, fouetter, ou autre petit morceau mais ferme de filament de cheveux naturels ou synthétiques. Coupez près de la base du filament à un angle de 45 °. Respecter la moustache à une pointe de micropipette P-1000 avec de la colle adhésif transparent permanent. </li></ol> 6. Microbead Implantation Plateau Préparation <ol><li> Mélanger 2 g d&#39;agarose dans 100 ml d&#39;une solution E3 pour faire un gel d&#39;agarose à 2% E3. </li><li> Chauffer la solution d&#39;agarose à 2% pendant 1 min et 30 sec dans une fiole d&#39;Erlenmeyer de 250 ml, en agitant le flacon toutes les 30 secondes pour éviter le gel de bouillonnant. </li><li> Prenez le couvercle d&#39;une boîte de Pétri de 15 mm x 60 mm et le placer dans une plus grande boîte de 150 mm x 15 mm avec l&#39;intérieur vers le haut. </li><li> Verser le gel d&#39;agarose chaude dans le 150 mm boîte de Pétri x 15 mm, en veillant à ancrer le basle couvercle de la plus petite assiette avec l&#39;index. Remarque: Prévoir une mince couche d&#39;agarose ci-dessous le couvercle du petit plat pour enlever la condensation qui se forme lorsque la coulée du gel; cela va rendre les perles plus facile à voir sous un microscope de dissection. </li><li> Comme l&#39;agarose se refroidit, mais avant qu&#39;il se solidifie, placer un moule bien sur le gel. Cela permettra de faciliter le placement des embryons. </li><li> Remarque: Afin d&#39;éviter les bulles dans les puits, placer le moule lentement à un angle jusqu&#39;à ce qu&#39;il flotte sur le dessus du gel. </li><li> Utiliser une microspatule, retirez soigneusement le moule de bien une fois le gel a solidifié. Ajouter la solution E3 et conserver à 4 ° C. </li></ol> 7. embryon Collection <ol><li> Préparer des chambres d&#39;accouplement, séparés par des cloisons, en les remplissant avec de l&#39;eau du système, puis en plaçant mâle adulte (s) et le poisson-zèbre (s) paires féminines dans les chambres O / N. </li><li> Ramassez les œufs fécondés à l&#39;aide d&#39;un grillage à mailles fines crépine (stades embryonnaires varient légèrement). </li><li> Déposer les oeufs fécondés dans un, de 10 cm de diamètre de Pétri propre en tournant le filtre à l&#39;envers et de rinçage avec un jet fin de l&#39;E3 jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y pas d&#39;œufs laissés dans la passoire, et il y environ 25 ml de solution E3 dans le plat. </li><li> Après la collecte, diviser les œufs dans plusieurs plats (environ 50-60 œufs par boîte) pour éviter la surpopulation, qui pourrait conduire à l&#39;asynchronisme du développement au sein de l&#39;embrayage et de faire la collecte fois les points souhaités difficile. </li><li> Incuber embryons en solution E3 à 28,5 ° C pour permettre l&#39;évaluation du développement conformément à la série de la mise en scène de poisson zèbre standard de 40. Remarque: Les embryons devraient être transférés à l&#39;E3 / PTU à 24 h après la fécondation (HPF) pour empêcher le développement de pigment si manipulations à des stades plus âgés nécessitent clarté optique. </li></ol> 8. Perle Implantation <ol><li> Incuber les microbilles de la concentration en molécule à tester ou le véhicule souhaité correspondant solution pendant le temps nécessaire dans un volume approprié. Remarque: Le chercheur peut utiliser des boîtes de Pétri stériles allant de 3-6 cm de diamètre, ou des plaques multi-puits, les deux qui permettent la visualisation des microbilles au sein de la solution. Le temps peut varier selon le type et la quantité de molécule d&#39;intérêt, et le chercheur doit se référer aux recommandations publiées fabricant ou pour une durée d&#39;incubation et d&#39;autres aspects tels que la sensibilité à la lumière et la température. </li><li> Une fois les embryons ont atteint le point de temps de développement souhaité, retirez les embryons de leurs chorions aide de pinces fines. </li><li> Incuber les embryons dans une solution de Ringer filtrée avec des antibiotiques pendant 10 minutes pour les acclimater à la solution. </li><li> Alors que les embryons sont Acclimatation, transférer les microbilles dans la plaque de microbilles niché dans le bac d&#39;implantation et rincez-les dans une solution de Ringer pour 10 min. Remarque: Implanter les perles à moins de 50 min après avoir atteint ce point. Ce wmalade diminuer la probabilité que l&#39;on va implanter un bourrelet avec une plus petite concentration de la molécule d&#39;intérêt. </li><li> Tableau des embryons dans les puits du plateau microbille d&#39;implantation, en prenant soin de les orienter de sorte que la zone d&#39;intérêt où la microbille sera implanté est accessible. </li><li> Faire une petite incision sur l&#39;embryon en utilisant l&#39;aiguille de tungstène. </li><li> Transférer une microbille sur l&#39;embryon aide de la pipette de transfert microcapillaire: appuyant l&#39;ampoule de la pipette, tirez doucement sur la microbille dans la colonne capillaire, puis relâchez la pression pour transférer la microbille à la destination souhaitée. </li><li> Utilisez l&#39;outil moustaches / fouet à positionner la microbille l&#39;intérieur de l&#39;embryon. Remarque: Veillez à positionner la microbille dans le tissu loin du site d&#39;incision de sorte que la microbille ne sera pas expulsé de l&#39;embryon comme il guérit. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Au cours du siècle passé, la compréhension du plan de corps structuration et l&#39;organogenèse a subi des avances monumentales. techniques de manipulation de tissus étaient critiques dans la découverte des informations clés sur ces processus vitaux. La modification génétique est l&#39;une des méthodes les plus couramment utilisées pour déterminer la fonction des gènes et des méthodes d&#39;analyse de la mosaïque, tels que la transplantation de cellules, de fournir des approches utiles pour comprendre l&#39;autonomie de la fonction des gènes. Implantation Microbead fournit un autre lieu d&#39;interroger comment les molécules notamment de modifier la dynamique de développement, car cette méthode permet au chercheur de modifier un environnement tissulaire locale en introduisant des molécules ou des inhibiteurs de la signalisation. Une gamme de microbilles différentes sont disponibles dans le commerce, qui ont différentes tailles et d&#39;autres propriétés physiques exister (par exemple, la charge) de telle sorte qu&#39;ils peuvent être utilisés pour les conditions expérimentales d&#39;intérêt. Ainsi, en implantant des microbilles qui sont trempés dans une protéine ou chimicocal d&#39;intérêt au sein d&#39;un organisme, les chercheurs peuvent étudier les effets localisés au cours du développement et de trouver des associations entre le gène ou d&#39;une molécule d&#39;intérêt et notamment phénotype (s) biologique. Des études comme celle effectuée par Wada et ses collègues utilisé microbille implantation afin d&#39;évaluer l&#39;effet de l&#39;augmentation de signalisation Hedgehog dans la structuration du squelette dans la boîte crânienne antérieure (ANC) chez le poisson zèbre 23. Des études antérieures ont montré que Shh est nécessaire pour la formation 14 de l&#39;ANC. Utilisant des microbilles Shh revêtus chercheurs ont identifié que ce signal favorise la formation du cartilage dans l&#39;ANC. Le processus d&#39;implantation de microbille a été utilisé pour démontrer un lien clair entre signalisation Hedgehog et la formation de cartilage dans l&#39;ANC. Un autre exemple clé de cette technique de manipulation des tissus chez le poisson zèbre est observé dans les études où les scientifiques ont étudié le contrôle transcriptionnel du Erythroblastoma vingt-six (ETS) domaine fmolécule apparentée-ETS des acteurs (Erm) et polyome activateur 3 (Pea3) par la signalisation FGF au début le développement du cerveau du poisson zèbre 19. Grâce à des expériences d&#39;implantation de microbilles, ils ont pu montrer que Fgf8 et FGF3 peuvent activer l&#39;expression ectopique de erm et PEA3. Ces exemples illustrent l&#39;utilité de microbilles à fournir des indications sur les mécanismes de développement qui collaborent lors de la formation des tissus, ce qui peut être bien caractérisé par l&#39;utilisation de méthodes d&#39;évaluation de l&#39;expression du gène 41. Ainsi, microbille transplantation peut être une méthode viable pour explorer d&#39;autres tissus, tels que le mésoderme intermédiaire (IM) qui donne naissance à du rein. Plus précisément, il aider dans les études de développement rénales, pour étudier comment différentes molécules affecte néphrons segmentation 42 et tubulogenèse 43,44, processus qui ne sont que superficiellement compris à l&#39;heure actuelle. En outre, microbille implantation a commencé à être utilisé au harasprocessus y de régénération chez le poisson zèbre 29] et pourraient être adaptés pour une utilisation avec n&#39;importe quel nombre de modèles de régénération d&#39;organes, tels que l&#39;ablation laser suivante de tissus embryonnaires comme le néphron 45 ou en conjonction avec des méthodes qui ont été formulés pour effectuer des recherches avec les structures adultes correspondants 46-49. Enfin, l&#39;implantation microbille a le potentiel pour être utilisé dans des modèles de maladies humaines telles que le cancer ou le tissu 50,51 52,53 dégénérescence. Dans le présent protocole, nous démontrons la méthode de microbille implantation dans embryons de poisson zèbre, qui a également été décrit de façon similaire par d&#39;autres chercheurs, mais non représentée par des protocoles de vidéo 1. Avec la pratique minimale, nous avons pu implanter microbilles à un taux approximatif de 8-10 embryons / h, ce qui concerne la faisabilité de cette procédure une fois le chercheur a une certaine expérience. Les résultats présentés ici démontrent que les perles de différentes dimensions peuvent être implantés à un stade précoce, et ce avec précaution, cette technique de manipulation des tissus peuvent être mises en oeuvre avec un minimum de perturbation physique de l&#39;embryon. Une amélioration qui mérite d&#39;être souligné est l&#39;utilisation d&#39;un outil moustaches / fouet à positionner la microbille dans l&#39;embryon. Cette pièce relativement peu coûteux et simple de l&#39;équipement est d&#39;environ le même diamètre que la microbille, est facile à obtenir et permet d&#39;accélérer le processus d&#39;implantation. La moustache / cils peut être coupée à la longueur désirée pour produire une entreprise encore outil de perles manipulation délicate, selon le chercheur de dextérité et de préférence. Enfin, alors que nous avons décrit ici comment manipuler physiquement microbilles et d&#39;embryons de poisson zèbre pour effectuer d&#39;implantation, ce protocole ne précise pas les procédures de manutention spécifiques pour différents médicaments ou peptides. En général, les microbilles traitées chimiquement devraient être implantés dans l&#39;animal avec l&#39;opportunisme, pour éviter les effets indésirables dans d&#39;autres régions de l&#39;organisme, et les chercheurs devraient être bien enformé sur les préoccupations de sécurité possibles associés à de tels produits chimiques avant d&#39;entreprendre leurs études. En somme, nous avons démontré une méthode relativement simple et efficace microbille implantation avec une large gamme d&#39;applications utilisant des matériaux qui sont facilement disponibles dans le laboratoire. En fin de compte, nous espérons que ce manuel aidera les chercheurs à la nature délicate de la manipulation des tissus de poisson zèbre.

Chercheurs en biologie du développement utilisent une vaste gamme de méthodes cellulaires, moléculaires et génétiques pour découvrir les mécanismes qui contrôlent la façon dont un organisme est formé. Parmi ces approches, la manipulation des tissus est un outil clé dans le décryptage des questions complexes sur le destin des cellules, le mouvement cellulaire, et l&#39;organisation des tissus. Une façon de modifier les environnements de tissus locaux se fait par l&#39;application chirurgicale de microbilles qui sont utilisés pour fournir une source focale de protéines ou d&#39;autres molécules de signalisation 1. Ce type de manipulation expérimentale a été largement mis en œuvre dans les modèles d&#39;embryologie vertébrés classiques, comme la grenouille et poussin 2. Le poisson zèbre est devenu un important organisme modèle vertébré pour l&#39;étude de l&#39;organogenèse et fournit également de nombreux avantages uniques pour la modélisation de la maladie 3-5 car ils partagent la conservation génétique élevée avec les humains 6. En particulier, la transparence optique et exle développement interne de l&#39;embryon de poisson zèbre offre un point de vue incomparable pour l&#39;observation de l&#39;ontogenèse des tissus 3-5. La mise en œuvre de grands écrans génétiques terme a généré un référentiel puissant de souches mutantes de poisson zèbre pour complément d&#39;étude 7,8, et l&#39;identification des techniques de dépistage alternatives qui peuvent être efficacement menée à échelle réduite dans les laboratoires simples 9,10. En outre travail expérimental avec le poisson zèbre a été facilitée par les progrès dans les méthodes transgéniques et inverser approches génétiques 11,12, ainsi que la génétique chimiques 13-15. techniques de manipulation des tissus, tels que la mise en oeuvre de microbilles, ne sont pas aussi largement utilisée dans le poisson zèbre, mais néanmoins fournir un outil utile pour mieux comprendre la signalisation cellulaire au cours du développement. Microbead implantation a été utilisé pour interroger les processus de formation d&#39;organes dans la rétine de poisson zèbre16,17, 18 coeur, le cerveau 19-22, la crête neurale 23, et la nageoire 24,25. Dans ces études et d&#39;autres, les perles ont été appliquées au cours du développement de comprendre la diffusion de molécules de signalisation 26, comment gradients affectent la migration des cellules 27 et la structuration axiale 28. Plus récemment, les microbilles ont été utilisées pour évaluer les mécanismes de régénération chez les adultes de poisson zèbre 29. Dans les études de développement, par exemple, le travail de microbilles poisson zèbre a donné un aperçu sur les mécanismes de formation des membres à travers des études de la nageoire pectorale 25. Le bourgeon nageoire pectorale poisson zèbre est homologue à l&#39;œuf des membres antérieurs dans le 30 souris et poussin 31. Le bourgeon vertébré membre dispose de deux nœuds de signalisation essentiels: la zone d&#39;activité polarisante (ZPA) qui établit l&#39;axe antéro-postérieur à travers l&#39;expression de Sonic Hedgehog (Shh) et des gènes cibles de Hox aval,et la crête ectodermique apicale (ARE) présente à l&#39;extrémité du bourgeon de membre, qui agit pour établir proximale à l&#39;identité distale du membre à travers l&#39;expression des facteurs de croissance des fibroblastes (FGF). En implantant des microbilles Fgf trempés dans de poisson zèbre mutants génétiques Shh, les enquêteurs FGF identifié comme essentiel à la progression du cycle cellulaire et la croissance de la branche 25 vertébré. En plus de FGF et Shh signalisation cascades qui établissent l&#39;identité de position, des études pionnières en utilisant le bourgeon poussin membre identifié l&#39;acide rétinoïque (RA) comme une molécule qui pourrait imiter l&#39;action de la région de polarisation pour établir l&#39;identité antérieure à postérieure 32. Ces expériences impliqués plaçant de petites bandes de papier Whatman RA-imbibé dans le membre de poussin pour évaluer chiffres structuration 32. En outre, les chercheurs ont effectué d&#39;autres études utilisant des élégantes l&#39;utilisation de microbilles, la transplantation de cellules, et exogèneTraitements de la PR chez le poisson zèbre pour déterminer que RA agit pour fournir à long terme les indices de position dans le cerveau postérieur poisson zèbre et le mésoderme 28. Cependant, à l&#39;heure actuelle de nombreuses questions demeurent sur les rôles des facteurs comme Fgf et RA de signalisation au cours de nombreux aspects du développement des vertébrés. Les effets de signalisation du RA, agissant comme un morphogène, l&#39;impact de nombreux organes 33, comme le cœur de développement 34 et les progéniteurs rénaux, où RA précise des cellules de rein proximales de type destins 35-39. Une meilleure compréhension de ces sujets pourrait bénéficier considérablement des études expérimentales en utilisant des techniques de manipulation des tissus et microbille implantation. Bien que peu d&#39;études ont été réalisées avec microbille implantation dans le poisson zèbre, par rapport à des modèles comme le poussin, ceux qui ont été menées ont été très instructif. Une des raisons de la rareté des microbilles implantation-recherche basé à l&#39;embryon de poisson zèbre est likely la notion selon laquelle il existe des problèmes techniques difficiles, sur la base de la taille de l&#39;embryon, qui constituent un obstacle à la réalisation avec succès de telles manipulations. Cependant, microbille implantation dans des embryons de poisson zèbre peut être appris avec la pratique et assistée par l&#39;observation visuelle de la technique, et peut donc être poursuivi comme un moyen d&#39;interroger les mécanismes de développement. Ici, nous démontrons l&#39;application précise d&#39;une microbille dans l&#39;embryon de poisson zèbre, qui peut être utilisé pour la réalisation d&#39;une grande variété de tests sur la formation du tissu et de la morphogenèse cellulaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate (Tricane)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Mo. P097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250mL Erlenmeyer Flask</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>FB-500-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saint-Gobain Chemware Microspatula</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>21-401-50B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-1000 Micropipette tips</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>2707402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature Incubator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11 690 516DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethly Sulfoxide</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads (45-106 &#181;m)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>140-1454 AG1-X8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbeads (45 &#181;m)</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>7314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Tweezer</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten Needle</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-6065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tube holder</td>
			<td>Globe Scientific Inc.&#160;</td>
			<td>51674</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microbead implantation in the zebrafish embryo

Le poisson zèbre a émergé comme un système de modèle génétique précieux pour l&#39;étude de la biologie du développement et de la maladie. Zebrafish part un haut degré de conservation génomique, ainsi que des similitudes dans les processus cellulaires, moléculaires et physiologiques, avec d&#39;autres vertébrés, y compris les humains. Au cours de l&#39;ontogenèse précoce, embryons de poisson zèbre sont optiquement transparent, ce qui permet aux chercheurs de visualiser la dynamique de l&#39;organogenèse utilisant un stéréomicroscope simple. Implantation microbille est une méthode qui permet la manipulation des tissus par la modification de facteurs dans les environnements locaux. Cela permet aux chercheurs pour analyser les effets d&#39;un certain nombre de molécules de signalisation d&#39;intérêt, tels que des peptides sécrétées, en des points spatiaux et temporels spécifiques au sein de l&#39;embryon en développement. Ici, nous détaillons un protocole pour la façon de manipuler et de perles d&#39;implants pendant le développement du poisson zèbre tôt.

Plusieurs types d&#39;outils de manipulation sont utiles pour le traitement des microbilles pendant les applications de recherche (Figure 1). En outre, un moule agarose simple avec petits puits peut être utilisé pour maintenir l&#39;embryon de poisson zèbre, ce qui est essentiel pour effectuer ces expériences dans une manière opportune et efficace (Figure 1). L&#39;implantation d&#39;une microbille peut être effectuée à la position spatiale et temporelle stade d&#39;intérêt, ce qui permet aux chercheurs de se rétrécissent une fenêtre d&#39;action spécifique pour la molécule d&#39;intérêt. Ici, les microbilles simples ont été implantés dans des embryons de poisson zèbre au stade queue de bourgeon ou à des points de temps plus tard, pendant les phases de somitogenèse (Figure 3). Deux microbilles de tailles différentes, rincés avec la solution de Ringer seul, ont été utilisés dans ce protocole de démonstration (figure 3A, 3B et 3C). Cette implantation de microbilles en l&#39;absence de tout conjuguépetites molécules démontre que les perles implantation peut être réalisée sans effets morphologiques bruts pendant le bon développement de l&#39;embryon de poisson zèbre (figure 4). L&#39;expérimentateur peut rencontrer des difficultés à la manoeuvre de la microbille dans le trou de la ponction faite par une aiguille de tungstène au sommet de l&#39;embryon. Pour parvenir à une meilleure gestion de la microbille une fois posé sur l&#39;embryon par la micro-aiguille, un cheveu / outil cils peut être utilisé. Cela peut être conçu avec naturellement hangar féline ou canine moustaches, bien que d&#39;autres filaments de cils naturels ou synthétiques peuvent être utilisés (Figure 1). Une légère poussée de la microbille soit avec l&#39;aiguille de tungstène ou l&#39;outil de moustache devrait voir la microbille sombrer dans la solution de Ringer du moule. Une fois que la microbille a coulé dans le moule, il doit être déplacé de grandes distances si nécessaire en utilisant l&#39;aiguille de tungstène et une fois au sommet de l&#39;embryon de l&#39;outil d&#39;aiguille ou whiskers peut être utilisé pour position la microbille dans l&#39;embryon. Le succès de l&#39;implantation de microbilles peut être mesuré grâce à la visualisation immédiatement à un stéréomicroscope, selon le bourrelet reste positionné de manière stable dans le tissu. Afin d&#39;évaluer la position des billes dans le temps, chaque échantillon d&#39;embryon peut être imagée par le biais direct décours temporel photographie ou vérifié à des intervalles périodiques (comme représenté sur la figure 4) pour faire en sorte que l&#39;emplacement de la bille n&#39;a pas changé au cours de la durée de l&#39;expérience à cause de tissu endogène morphogenèse. Comprendre la position de la bille au fil du temps est essentielle pour l&#39;interprétation la plus informés des résultats, comme l&#39;évaluation de l&#39;effet d&#39;une petite molécule sur un tissu cible ou processus de développement. L&#39;utilisation de ces étapes ci-dessus fournira un environnement idéal pour incruster des microbilles dans l&#39;embryon de poisson zèbre à une heure et la position souhaitée. Dans notre expérience, les utilisateurs novices de ce protocole microbille d&#39;implantation généralement gagné le nec de compétencesnéces- pour effectuer l&#39;implantation chirurgicale cohérente de microbilles dans l&#39;embryon de poisson zèbre après environ une semaine de pratique. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" /> Figure 1. Outils utilisés pour effectuer des microbilles implantation. (A) Le plateau d&#39;implantation de talon (gauche, 15 cm de diamètre) avec des moules de l&#39;embryon (à gauche) et un plateau microbille d&#39;incubation (à droite, 6 cm de diamètre). Ce plateau de travail permet au chercheur de placer les embryons dans l&#39;orientation désirée pour microbille implantation, et d&#39;avoir des microbilles préparées pour une implantation à proximité immédiate de la station de microscope. Les microbilles doivent être incubées à petite molécule (s) et / ou le véhicule, puis rincées dans une plaque séparée de microbilles (à droite) avant de les placer dans le bac d&#39;implantation de talon qui est positionné sous la station de microscope. (B) Deux paires de pinces fines seront utilisés pour enlever la chorisur entourant chaque embryon de poisson zèbre et aussi à rompre l&#39;extrémité de l&#39;aiguille de micro-capillaire. (C) Une aiguille de tungstène sera employée pour faire une très fine ponction dans l&#39;embryon de poisson zèbre dans lequel de positionner la microbille. (D) La pipette de transfert microcapillaire sera utilisé pour ramasser et positionner une microbille sur le dessus de l&#39;embryon de poisson zèbre à proximité du site de la ponction. (E) La moustache / outil cils va permettre le positionnement en douceur de la microbille dans le site de l&#39;incision au sein de l&#39;embryon qui a été précédemment faite par l&#39;aiguille de tungstène. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" /> Figure 2. Représentation schématique de la procédure d&#39;implantation microbille. (A) Un bac d&#39;implantation de microbilles avec des microbilles soaking dans la solution de lavage désiré est mis en place en vertu d&#39;une station de stéréoscopique, et les embryons positionné avec le tissu vers le haut. (B) En utilisant une aiguille de tungstène, une petite incision dans l&#39;embryon peut être faite avec un léger mouvement énergique encore. (C) en utilisant une pipette de transfert microcapillaire, la microbille souhaitée peut être ramassé de la chambre microbille d&#39;incubation dans le bac, situé sur la droite, et amené au compartiment gauche, où la zone de travail de l&#39;embryon est situé. La microbille doit être déposé à proximité du site de l&#39;incision, alors positionné doucement dans le site de l&#39;incision faite par l&#39;aiguille de tungstène en utilisant la moustache / outil cils. Une fois une microbille est manoeuvré dans le site de l&#39;incision, il doit être rentré dans le tissu (loin de l&#39;incision) pour positionner de manière stable la microbille et prévenir le déplacement ultérieur de l&#39;embryon que le développement continue. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">P</a>louer cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" /> Figure 3. microbilles peuvent être implantés dans des embryons à différents stades de développement. (A) embryons de poisson zèbre ont été implantés avec une microbille (diamètre d&#39;environ 50 um) dans le coffre au stade queue de bourgeon. Lorsque examiné à l&#39;implant poste de talon de 24 heures (de hpbi), les embryons avaient développé normalement et la microbille a montré un minimum de mouvement lors du passage du temps de développement. (B) embryons de poisson zèbre implantés avec des microbilles (avec un diamètre d&#39;environ 50 um) dans le sac jaune au stade 3 de somites (ss) affichés développement normal avec le mouvement du talon relativement mineur au fil du temps. (C) plus grands microbilles (diamètre d&#39;environ 70 um) ont été implantés dans l&#39;embryon 7 ss similaire a montré le développement ultérieur normal, ainsi que des mini-mal si un mouvement à partir du site d&#39;implantation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" /> Figure 4. développement bruts de l&#39;embryon de poisson zèbre est perturbé par la présence d&#39;une microbille à 72 hpbi. Embryons de poisson zèbre ont été implantés avec des microbilles trempés dans une solution de Ringer (avec un diamètre d&#39;environ 50 um) au stade 7 somites (ss). Chaque microbille a été chirurgicalement inséré dans le coffre, entre les somites 3 ​​et 4. La présence de la perle n&#39;a pas été associée à des défauts manifestes de développement au implant poste de talon de 24 heures (de hpbi), 48 hpbi, ou 72 hpbi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.</a>

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Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead implantation dans l&#39;embryon de poisson zèbre

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

microbead-implantation-in-the-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.1K vues.  University of Notre Dame. The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Vidéo: Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Recherche

Biologie du développement

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Observer Division et dynamique mitotique dans un embryon de poisson zèbre en direct

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

La micro-injection et l&#39;électroporation d&#39;embryons dans le chordés<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods are described here to analyze distinct populations of MTs in the developing neural tube of the zebrafish embryo. While the focus is on neural tissue, this methodology is broadly applicable to other tissues. The procedures are optimized for early to mid-somitogenesis-stage embryos (1 somite to 12 somites), however they can be adapted to a range of other stages with relatively minor adjustments. The first protocol provides a method to assess the spatial distribution of stable and dynamic MTs and perform a quantitative analysis of these populations with image-processing software. This approach complements existing tools to image microtubule dynamics and distribution in real-time, using transgenic lines or transient expression of tagged constructs. Indeed, such tools are very useful, however they do not readily distinguish between dynamic and stable MTs. The ability to image and analyze these distinct microtubule populations has important implications for understanding mechanisms underlying cell polarization and morphogenesis. The second protocol outlines a technique to analyze nascent MTs specifically. This is accomplished by capturing the de novo growth properties of MTs over time, following microtubule depolymerization with the drug nocodazole and a recovery period after drug washout. This technique has not yet been applied to the study of MTs in zebrafish embryos, but is a valuable assay for investigating the in vivo function of proteins implicated in microtubule assembly.

Immunolabeling methods to analyze distinct populations of microtubules in the developing zebrafish brain are described here, which are broadly applicable to other tissues. The first protocol outlines an optimized method for immunolabeling stable and dynamic microtubules. The second protocol provides a method to image and quantify nascent microtubules specifically.

Utilisation d’immunomarquage pour analyser des Microtubules stables et dynamiques naissants dans l’embryon de poisson zèbre

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. Various propositions claim to have been important contributions to the understanding of the mechanical properties of cells and tissues in their spatiotemporal organization in different developmental and morphogenetic processes. However, due to the lack of reliable and accessible tools to measure material properties and tensional parameters in vivo, validating these hypotheses has been difficult. Here we present methods employing atomic force microscopy (AFM) and particle tracking with the aim of quantifying the mechanical properties of the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. Epiboly is an early conserved developmental process whose study is facilitated by the transparency of the embryo. These methods are simple to implement, reliable, and widely applicable since they overcome intrusive interventions that could affect tissue mechanics. A simple strategy was applied for the mounting of specimens, AFM recording, and nanoparticle injections and tracking. This approach makes these methods easily adaptable to other developmental times or organisms.

The lack of tools to measure material properties and tensional parameters in vivo prevents validating their roles during development. We employed atomic force microscopy (AFM) and nanoparticle-tracking to quantify mechanical features on the intact zebrafish embryo yolk cell during epiboly. These methods are reliable and widely applicable avoiding intrusive interventions.

AFM et microrhéologie dans la cellule de jaune de œuf embryon de poisson zèbre

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout (Oncorhynchus Mykiss) and Brown Trout (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on fish abdomens to expel the eggs. An alternative method uses the pressure of gas injected into the body cavity, which causes the subsequent release of the eggs. This method is believed to have less negative effects on both the welfare and egg quality of the broodstocks. Herein, we compare the results of air and hand stripping methods with respect to one-year survival and egg quantity and quality in two salmonid fish, rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and brown trout (Salmo trutta morpha fario). Our results indicate that air stripping yielded a better quality of eggs and higher one-year survival rate in rainbow trout. In addition, air stripping resulted in lower mortality rate than the group subjected to hand stripping (25% vs. 35%). The pH and hatching rate of the hand stripped group was lower than those of the air stripped group. In the case of brown trout, the quality of eggs obtained by both hand and air-stripping methods was similar; however, the one-year losses in fish were higher in air stripped group (15% compared to 0% in hand stripped fish). Although the advantages of air stripping method over hand stripping in terms of egg quality might not be observed in all salmonid species, the air-stripping procedure might be a promising option to be adopted in hatcheries as it ensures a high level of reproducibility and efficiency.

Effectiveness of the Air Stripping in Two Salmonid Fish, Rainbow Trout Oncorhynchus Mykiss and Brown Trout Salmo Trutta Morpha fario

The principal aim of this study is to standardize and test the pneumatic method (air stripping) of collecting eggs in rainbow trout and brown trout. This method allows effective and simple collection of the eggs without the necessity of fish abdomen massage.

Efficacité du Stripping Air dans deux poissons salmonidés, truite arc-en-ciel (Oncorhynchus Mykiss) et la truite brune (Salmo Trutta Morpha fario)

Egg collection is one of the most crucial procedures during fish reproduction in salmonid hatcheries. Classic methods involve the use of hand massage on ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Mouvements de tissu endocardique suivant via Photoconversion de cellules dans l’embryon de poisson zèbre

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal and postnatal consequences. To ensure the innocuousness of ART applications, studies in animal models are necessary. In addition, as a last step, embryo development studies require evaluation of their capacity to develop full-term healthy offspring. Here, embryo transfer to the uterus is indispensable to perform any ARTs-related experiment.
The rabbit has been used as a model organism to study mammalian reproduction for over a century. In addition to its phylogenetic proximity to the human species and its small size and low maintenance cost, it has important reproductive characteristics such as induced ovulation, a chronology of early embryonic development similar to humans and a short gestation that allow us to study the consequences of ART application easily. Moreover, ARTs (such as intracytoplasmic sperm injection, embryo culture, or cryopreservation) are applied with suitable efficiency in this species.
Using the laparoscopic embryo transfer technique and the cryopreservation protocol presented in this article, we describe 1) how to transfer embryos through an easy, minimally invasive technique and 2) an effective protocol for long-term storage of rabbit embryos to provide time-flexible logistical capacities and the ability to transport the sample. The outcomes obtained after transferring rabbit embryos at different developmental stages indicate that morula is the ideal stage for rabbit embryo recovery and transfer. Thus, an oviductal embryo transfer is required, justifying the surgical procedure. Furthermore, rabbit morulae are successfully vitrified and laparoscopically transferred, proving the effectiveness of the described techniques.

Assisted reproductive techniques (ARTs) are in continuous evaluation to improve outcomes and reduce the associated risks. This manuscript describes a minimally invasive embryo transfer procedure with an efficient cryopreservation protocol that allows the use of rabbits as an ideal animal model of human reproduction.

Transfert d’embryon et vitrification d’embryons au stade optimal de l’embryon dans le modèle Rabbit

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Microinjection-based System for In Vivo l’Implantation des Cardiomyocytes embryonnaires chez l’embryon aviaire

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...