This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.

1. cella di placcatura e trasfezione <ol><li> In una cappa di coltura cellulare, piatto ~ 300.000 ~ 500.000 SN56 cellule (un gentile dono del Dr. Jane Rylett) su un piatto di confocale fondo di vetro a 35 mm e coprire con i media pre-trasfezione (Dulbecco Modified Eagle Medium, DMEM, integrato con 10% FBS). </li><li> Incubare le cellule notte a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% a proliferare. Nota: Le cellule devono essere circa il 50% -70% confluenti prima trasfezione. </li><li> In una cappa di coltura cellulare, le cellule trasfezione con plasmidi che esprimono una proteina fluorescente taggati TGN marcatore (galactosyl transferasi accoppiato ad Cyan Fluorescent Protein, GalT-PCP), una proteina fluorescente tag marcatore vano (qui, lisosomi associato membrana proteina 1, LAMP1, con etichetta MRFP), e la proteina di interesse taggati con paGFP (βAPP-paGFP). (Questi costrutti sono stati precedentemente descritti 30) </li><li> Incubare le cellule con il reagente di trasfezione e plasmide DNA fo 24 ore a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Utilizzare un rapporto di ~ 2 mg di DNA a 5 ml di agente trasfezione (ad es Lipofectamine 2000) al meglio citotossicità equilibrio ed efficienza di trasfezione. Le concentrazioni reali possono avere bisogno di essere ottimizzato per diverse plasmidi. Negli esperimenti qui descritti, utilizzare 1 mg / piatto confocale di βAPP-paGFP, 0.3 mg / piatto confocale di LAMPADA1-MRFP, e 0,2 mg / piatto confocale di Galt-PCP. Nota: La quantità di plasmide usato dipenderà l&#39;efficienza di trasfezione. </li><li> Per le linee di cellule neuronali: Dopo il punto 1.4, in una cappa di coltura cellulare, rimuovere i supporti pre-trasfezione e differenziare le cellule SN56 a 2 ml di DMEM integrato con 0,1% di penicillina / streptomicina con 1 mM dibutirril AMP ciclico (dbcAMP) per 24 ore. </li></ol> 2. Microscopio fase di preparazione <ol><li> Preriscaldare PBS (PBS) e soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a 37 ° C. Warm-up palco microscopio prima imaging a 37 ° C. </li><li> Lavare le cellule due volte con PBS, per rimuovere i media differenziazione e sostituirli con 2 ml di HBSS a 37 ° C. Cellule posto sul palco microscopio riscaldato a 37 ° C. Nota: Le cellule sono vitali per circa 1,5-2 ore in HBSS. </li><li> Lasciare 5-10 min per la temperatura della piastra confocale per equilibrare con palco microscopio. </li></ol> 3. fotoattivazione di ROI sulla Golgi <ol><li> Con l&#39;oculare del microscopio, trovare cellule trasfettate con GalT-CFP, LAMP1-MRFP, e βAPP-paGFP. <ol><li> Utilizzare un obiettivo ad immersione in olio con alto ingrandimento (es 63X o 100X). Per la conformazione visiva della fluorescenza, utilizzare un filtro impostato in grado di visualizzare FITC (per PCP e fluorescenza GFP) e rodamina (per MRFP fluorescenza). </li></ol></li><li> Impostare la fetta confocale per ogni canale a 1 micron. Prendete una immagine a bassa risoluzione. </li><li> Ritaglia immagine solo la cella di interesse. </li><li> Usando la manopola di regolazione, impostare manualmenteil piano focale al centro della cella. Questo è tipicamente la parte della cellula dove il nucleo è il più grande. </li><li> Pareggio 3-5 Regioni circolari di Interesse (ROI) all&#39;interno del TGN (GalT-PCP fluorescenza). <ol><li> Per disegnare ROI (cioè nel programma Zeiss LSM), selezionare il pulsante &#39;Modifica ROI&#39; nella console di comando. </li><li> Selezionare il pulsante ROI circolare. </li><li> Fare clic e trascinare su GalT-CFP regioni positivi della cellula. Nota: I pacchetti foto-sbiancanti per molti microscopi hanno questa capacità. </li></ol></li><li> Prendete l&#39;immagine della cella con sovrapposto ROI. Salvare una copia del ROI per riferimento futuro. <ol><li> Per salvare il ROI per l&#39;immagine, selezionare il pulsante &#39;Macro&#39;. </li><li> Premere il pulsante &#39;Carica&#39; per avviare il &#39;CopyRoisToOverlay&#39; (percorso del file: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb). Nota: Un microscopio confocale dotato di 475-525 nm (PCP) banda passante (BP), un 500-530 nm BP (GFP),e sono tenuti a 560 nm passaggio lungo (LP) set di filtri. È inoltre necessario un laser argon 458 nm e 488 nm di emissione e un laser HeNe per l&#39;emissione a 540 nm. </li></ol></li><li> Set-up il microscopio per un corso a tempo candeggina. <ol><li> Impostare il diodo laser (25 mW 405 nm laser) alla massima potenza. Attenzione: Eccessiva foto-attivazione potrebbe portare a foto-tossicità o danni alle membrane cellulari. Usare occhiali di protezione per evitare danni alla retina. </li><li> Set-up del microscopio per 120 cicli di imaging. Nota: Un ciclo di imaging consiste di sbiancamento all&#39;interno del ROI e l&#39;imaging di tutta la cellula. Si tratta di un corso a tempo candeggina. </li><li> Impostare il microscopio per candeggina (foto disattivare) solo il ROI per 20-30 iterazioni dopo ogni immagine. Il tempo di immagine e candeggina un&#39;immagine varierà. Impostare un tempo di ritardo tra le immagini in modo che ogni ciclo è di circa 30 secondi. Nota: La parte di imaging di ogni ciclo dura circa 15-30 secondi a seconda della dimensione dell&#39;immagine. Lo sbiancamento per ogni ROI è circa 50 msec. Bleaching dei 4 ROI per 20 iterazioni avrà 4 secondi alla fine di ogni ciclo di candeggiante / immagine. </li></ol></li><li> Inizia il periodo di tempo di candeggina. </li><li> Spegnere il candeggio dopo 15 min (30 cicli di imaging e sbiancamento), ma continuare ad acquisire foto della cellula. Nota: Il tempo da 0 a 15 min è il periodo di &#39;impulso&#39;. </li><li> Continuare ad acquisire foto per 45 min (senza sbiancamento), a seguire la clearance di βAPP-paGFP. Nota: Il tempo 15 a 45 minuti è il periodo di &#39;caccia&#39;. </li><li> Utilizzando il metodo di analisi descritto al punto 6, co-localizzare la proteina di interesse (qui, βAPP-paGFP) con il vano di interesse (qui, LAMP1-MRFP) facendo superfici a ciascun canale. </li></ol> 4. Determinare il Comparto Downstream <ol><li> Per determinare se lisosomi (in questi esperimenti) sono compartimento finale, aggiungere inibitori della proteasi di membrana permeabile a causare proteine ​​si accumulano nei lisosomi.<ol><li> Per βAPP, utilizzare 0,5 micron L685, 458 (inibitore specifico γ-secretasi) durante la notte o 100 micron clorochina (deacidifies lisosomi) per 30 minuti prima di imaging. </li></ol></li><li> Trova cellule e photoactivate come nel passaggio 3,1-3,8. </li><li> Immagine della cella per un ulteriore 45 min (senza foto-attivazione) per determinare dove βAPP-paGFP accumula in assenza di scissione. </li><li> Analizzare la consegna di proteine ​​per lisosomi (o altro vano a valle) e successiva liquidazione secondo il metodo descritto al punto 6. </li></ol> 5. assicurare l&#39;accuratezza della foto-attivazione entro il Golgi <ol><li> Warm-up HBSS a 37 ° C. </li><li> Preparare una soluzione al 2 ml, per ogni piatto confocale a essere ripreso, di 66 micron nocodazole (trattamento) o DMSO (controllo) in HBSS. <ol><li> Per un piatto confocale, pipetta 2 ml di 37 ° C HBSS e aggiungere 7,96 ml di nocodazole da un nocodazole magazzino 16.60 mm. </li><li> Come controllo cosìluzione, pipetta 2 ml di 37 ° C in una provetta HBSS 2 ml e aggiungere 7,96 ml di DMSO. </li></ol></li><li> Incubare cellule in HBSS con nocodazole o DMSO per 5 minuti prima di imaging. </li><li> Trova le cellule come al punto 3.1. </li><li> Prima fotoattivazione, preparare il microscopio per prendere un Z-stack dopo il periodo di fotoattivazione. <ol><li> Fare clic sul pulsante &#39;Z Stack&#39;. Avviare la scansione utilizzando XY veloce. </li><li> Regolare il piano focale con la manopola di regolazione microscopio per la parte superiore della cella. Premere &#39;Mark First&#39; per impostare la prima posizione nella pila. </li><li> Regolare il piano focale con la manopola di regolazione del microscopio al fondo (più vicino al vetro) della cella. Premere &#39;Mark Ultimo&#39; per impostare l&#39;ultima posizione nella pila. </li><li> Nel pannello pila Z, premere il tasto &#39;Z sezionamento&#39;. Impostare l&#39;&#39;intervallo&#39; a 1 micron. Nota: per una risoluzione spaziale più alta pila un intervallo più piccola pila, ma altre immagini dovrannoadottare allungando il periodo di imaging per lo stack. </li></ol></li><li> Bleach le cellule, come descritto al punto 3.7-3.8. Foto-activate e immagini da 0 min a 15 min (30 fotogrammi). </li><li> Smettere di imaging dopo 30 fotogrammi. Immediatamente salvare un&#39;immagine del video. Attenzione: alcuni microscopi possono sovrascrivere primo video se non viene salvato prima di iniziare una seconda sequenza di imaging. </li><li> Dopo aver salvato il video, acquisire immediatamente un Z-stack, utilizzando i parametri dal punto 5.5. </li><li> Co-localizzare βAPP-paGFP con GalT-CFP (o altro marcatore Golgi), come descritto al punto 6. Nota: CFP photobleaches rapidamente e possono non essere visibili dalla fine del periodo di imaging. Colocalization potrebbe non essere possibile con GalT-PCP. Se è necessaria una co-localizzazione, utilizzare MRFP di tag GalT. </li></ol> 6. Filtraggio vescicole e Colocalizzazione <ol><li> Utilizzare un programma di analisi (es Imaris) per rendere le superfici del vano (ad esempio LAMP1-MRFP) e una proteina ointeresse f (ad es βAPP-paGFP). </li><li> Entra nella sezione &#39;Surpass&#39; del programma di analisi facendo clic sul pulsante Surpass sulla barra dei menu in alto. </li><li> Selezionare il pulsante wizard di superficie nella parte superiore del pannello di sinistra più (5 ° pulsante da sinistra). </li><li> Selezionare il canale da filtrare vescicole (cioè βAPP-paGFP fluorescenza, proteina di interesse). </li><li> Eseguire sfondo sottrazione presentando il diametro del più grande vescicole in campo per la procedura guidata e premere avanti. Il programma di analisi seleziona automaticamente - sulla base di una soglia derivato dal grande vescicole nel campo - un&#39;area nel canale di interesse. <ol><li> Regolare manualmente lo sfondo di soglia per rifinire la selezione, se necessario. </li></ol></li><li> Nella parte inferiore della schermata di selezione della soglia, selezionare l&#39;opzione &#39;toccare oggetti Split &quot;per separare il combinato superfici. Nota: Se molti vescicole sono strettamente raggruppati persieme, il programma di analisi volontà gruppo questi oggetti in una superficie. <ol><li> Scegli 10-15 vescicole rappresentativi e calcolare il diametro medio delle vescicole e inserire il risultato nella procedura guidata. </li></ol></li><li> Perfezionare i punti seme selezionati aumentando o diminuendo la soglia su &#39;Quality&#39; (intensità del canale al centro di ogni spot). Verrà creato superfici del canale di interesse: Nota. Ulteriore affinamento delle superfici selezionate può essere eseguita in questo punto. Vescicole soglia in base al numero di pixel in ciascun vescicole. </li><li> Mascherare il canale originale con questa superficie. Per mascherare, selezionare la scheda 4 ° da sinistra nella procedura guidata di creazione di superfici (matita). </li><li> Seleziona &#39;mascherare tutti&#39;. Verrà creato un nuovo canale con le vescicole di interesse. Nota: Durante il processo di maschera, la possibilità di duplicare il canale originale viene offerto. Selezionare questa opzione se i dati originali deve essere salvato. </li><li> Ripetere steps 6.1 tramite 6.7 per il canale non filtrato (cioè LAMP1 MRFP, vano). </li><li> Alla barra degli strumenti in alto, selezionare lo strumento colocalizzazione. <ol><li> Nel pannello superiore, come appaiono gli istogrammi dei canali da colocalized, selezionare i canali mascherati recente creazione. </li><li> Selezionare tutti i dati disponibili. Ci sono pixel scuri che a volte sono presenti dopo l&#39;analisi. Non selezionare questi pixel nell&#39;istogramma, saranno falsare i risultati. </li><li> Nel pannello a destra, selezionare &#39;Crea Coloc Channel&#39;. Questo crea un nuovo canale che contiene solo i pixel colocalized. I dati saranno nello stesso pannello sotto il pulsante &#39;Statistiche Channel&#39;. I dati possono essere esportati come file CSV. </li><li> Utilizzare la statistica &#39;Percentuale di materiale colocalizzava&#39;. Questa opzione tiene conto dell&#39;intensità dei pixel e le dimensioni dell&#39;oggetto. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Masters, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+plaque+core+protein+in+Alzheimer+disease+and+Down+syndrome.">Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).</li><li>Vassar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-secretase+cleavage+of+Alzheimer's+amyloid+precursor+protein+by+the+transmembrane+aspartic+protease+BACE.">Beta-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE.</a> Science. 286 (5440), 735-741 (1999).</li><li>De Strooper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+presenilin-1+inhibits+the+normal+cleavage+of+amyloid+precursor+protein.">Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein.</a> Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+complexes+with+the+C-terminal+fragments+of+amyloid+precursor+protein+at+the+sites+of+amyloid+beta-protein+generation.">Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).</li><li>Li, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+1+is+linked+with+gamma-secretase+activity+in+the+detergent+solubilized+state.">Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).</li><li>Kim, W., Hecht, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+enhanced+amyloidogenicity+of+Alzheimer+A{beta}42+peptide+relative+to+A{beta}40.">Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40.</a> J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).</li><li>Pawar, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+'aggregation-prone'+and+"aggregation-susceptible.">Prediction of 'aggregation-prone' and "aggregation-susceptible.</a> J. Mol. Biol. 350 (2), 379-392 (2005).</li><li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS35+haploinsufficiency+increases+Alzheimer's+disease+neuropathology.">VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer's disease neuropathology.</a> J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).</li><li>Rogaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+sortilin-related+receptor+SORL1+is+genetically+associated+with+Alzheimer+disease.">The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease.</a> Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).</li><li>Andersen, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+sorting+protein-related+receptor+sorLA/LR11+regulates+processing+of+the+amyloid+precursor+protein.">Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).</li><li>Schmidt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SorLA/LR11+regulates+processing+of+amyloid+precursor+protein+via+interaction+with+adaptors+GGA+and+PACS-1.">SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1.</a> J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).</li><li>Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+anti-amyloid+immunotherapy+in+Alzheimer's+disease:+What+are+the+most+promising+targets.">Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer's disease: What are the most promising targets.</a> Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).</li><li>Pasternak, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1,+nicastrin,+amyloid+precursor+protein,+and+gamma-secretase+activity+are+co-localized+in+the+lysosomal+membrane.">Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane.</a> J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).</li><li>Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+alkalizing+agents+on+the+processing+of+the+beta-amyloid+precursor+protein.">Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein.</a> Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).</li><li>Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+the+amyloid+protein+precursor+to+potentially+amyloidogenic+derivatives.">Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives.</a> Science. 255 (5045), 728-730 (1992).</li><li>Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+beta-amyloid+formation+identifies+proteolytic+precursors+and+subcellular+site+of+catabolism.">Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism.</a> Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxyl-terminal+Fragments+of+Alzheimer+beta+-Amyloid+Precursor+Protein+Accumulate+in+Restricted+and+Unpredicted+Intracellular+Compartments+in+Presenilin+1-deficient+Cells.">Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells.</a> J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).</li><li>Perez, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+identifies+new+signals+for+beta-amyloid+precursor+protein+endocytosis,+turnover,+and+the+generation+of+secreted+fragments,+including+Abeta42.">Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42.</a> J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).</li><li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+Is+Required+for+Synaptic+Activity-Dependent+Release+of+Amyloid-&#946;+In+Vivo.">Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-&#946; In Vivo.</a> Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).</li><li>Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dynamin-dependent+endocytosis+increases+shedding+of+the+amyloid+precursor+protein+ectodomain+and+reduces+generation+of+amyloid+beta+protein.">Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein.</a> BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).</li><li>Traub, L. M., Kornfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trans-Golgi+network:+a+late+secretory+sorting+station.">The trans-Golgi network: a late secretory sorting station.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).</li><li>Vieira, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+the+Alzheimer's+amyloid+precursor+protein+from+the+endosome+to+the+TGN+is+S655+phosphorylation+state-dependent+and+retromer-mediated.">Retrieval of the Alzheimer's amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated.</a> Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).</li><li>Sullivan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer+disruption+promotes+amyloidogenic+APP+processing.">Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing.</a> Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).</li><li>Fjorback, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer+binds+the+FANSHY+sorting+motif+in+SorLA+to+regulate+amyloid+precursor+protein+sorting+and+processing.">Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing.</a> J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Photoactivatable+GFP+for+Selective+Photolabeling+of+Proteins+and+Cells.">A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+photolabeling+of+proteins+using+photoactivatable+GFP.">Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP.</a> Methods. 32 (4), 445-450 (2004).</li><li>Hirschberg, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+secretory+protein+traffic+and+characterization+of+golgi+to+plasma+membrane+transport+intermediates+in+living+cells.">Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells.</a> J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).</li><li>Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER.">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).</li><li>Hailey, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+supply+membranes+for+autophagosome+biogenesis+during+starvation.">Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation.</a> Cell. 141 (4), 656-667 (2010).</li><li>Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyloid+Precursor+Protein+is+rapidly+transported+from+the+Golgi+apparatus+to+the+lysosome+and+where+it+is+processed+into+beta-amyloid.">The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid.</a> Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).</li><li>Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+logic+underlying+the+axonal+transport+of+cytosolic+proteins.">Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins.</a> Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).</li><li>Herl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+amyloid+precursor+protein+affect+its+interactions+with+presenilin/gamma-secretase.">Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase.</a> Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).</li><li>Lorenzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Direct+Transport+of+Cell+Surface+APP+to+the+Lysosome+defines+a+novel+selective+pathway.">Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway.</a> Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).</li><li>Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+'Swedish'+amyloid+precursor+protein+variant+in+neuro2a+(N2a)+cells.+Evidence+that+cleavage+at+the+beta-secretase";site+occurs+in+the+golgi+apparatus.">Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus.</a> J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).</li><li>Thinakaran, G., Koo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+Precursor+Protein+Trafficking,+Processing,+and+Function.">Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function.</a> J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).</li><li>Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Activation+and+Excitation+Properties+of+PA-GFP+in+the+720-920-nm+Region.">Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region.</a> Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).</li><li>Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+export+of+the+vesicular+stomatitis+virus+G+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+requires+a+signal+in+the+cytoplasmic+tail+that+includes+both+tyrosine-based+and+di-acidic.">Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic.</a> 11 (1), 13-22 (2000).</li><li>Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+products+of+amyloid-beta+precursor+protein+are+sorted+to+distinct+carrier+vesicles+that+are+independently+transported+within+neurites.">The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites.</a> J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari in competizione o conflitti di interesse.

Questa tecnica descrive l&#39;esatto foto-attivazione delle proteine ​​di membrana taggati con paGFP nel TGN di visualizzare la successiva tratta e scissione. Mentre paGFP è stato creato oltre dieci anni fa 25, questo è il primo esempio di accurata foto-attivazione per seguire il traffico di proteine ​​nascenti ai compartimenti a valle. Studi precedenti utilizzando APP-paGFP costruisce foto-attivata una regione peri-nucleare della cellula, che è stato considerato il Golgi 11. Tuttavia, c...

Il segno distintivo della malattia di Alzheimer (AD) è la presenza di placche senili e grovigli neurofibrillari (NFTS) nel cervello. Il principale costituente delle placche senili è β-amiloide (A?). Ap è derivato dal suo precursore; proteina precursore dell&#39;amiloide (APP) 1. Il clivaggio amiloidogenica di APP inizia con la rimozione del ectodomain da APP da β-secretasi 2. Il frammento terminale carbossilico 99-residuo che rimane (CTF) può essere scisso da γ-secretasi per produrre Ap 3-7. Mentre molti esperimenti hanno documentato il clivaggio di superficie cellulare APP dopo interiorizzazione dalla superficie cellulare nel sistema endosomal / lisosomiale, numerosi studi recenti hanno suggerito che il traffico intracellulare di APP è anche importante nel regolare la sua lavorazione 8-11. Ci sono stati un certo numero di tentativi di modulare i livelli di Ap con inibitori gamma-secretasi e A? Immunotherapies. Tuttavia, recenti studi clinici con queste terapie hanno mostrato alcun beneficio, e, in alcuni casi, ha causato danni 12. Una strategia inutilizzato ai modulare la produzione Ap è di alterare la localizzazione sub-cellulare di APP e interazione γ-secretasi. Golgi, membrana plasmatica, e endosomi / lisosomi sono stati suggeriti come possibili locali per γ-taglio di APP. Una ricerca dal nostro laboratorio suggeriscono che APP e la γ-secretasi sono proteine ​​residenti della membrana lisosomiale 13. Inoltre, abbiamo trovato che la lisosomiali γ-secretasi ha un pH ottimale acido 13. Inoltre, alcalinizzazione del sistema endosomal / lisosomiale con clorochina o NH 4 Cl, ha dimostrato di diminuire la produzione di Ap 14. gamma-secretasi inibizione o knockout o Presenilina porta all&#39;accumulo APP-CTFs nei lisosomi 15-17. Inoltre, interrompendo APP endocitosi abbassa produzione Ap 18-20. Nonostante l&#39;importanza del Golgi come stazione di smistamento per le proteine ​​nascenti e le proteine ​​riciclati dal sistema endosomal / lisosomiale, il traffico intracellulare di APP non è stato studiato in dettaglio 21. Studi recenti hanno dimostrato che l&#39;APP può essere riciclato alla rete trans-Golgi (TGN) attraverso l&#39;interazione con il complesso retromer. Regolazione Giù del complesso retromer diminuisce la produzione Ap 8,22-24. Tuttavia, l&#39;uscita di APP dal Golgi non è stato ben studiato. Pur seguendo l&#39;endocitosi delle proteine ​​di superficie cellulare, quali il recettore della transferrina, sono facilmente etichettato e seguita, dopo il traffico di proteine ​​intracellulari è più impegnativo. In realtà, poche proteine ​​hanno avuto il loro traffico intracellulare ripreso. L&#39;avvento di tag proteina fluorescente, come foto-attivabili-GFP (paGFP), ha fornito nuovi strumenti per esaminare il traffico intracellulare. Foto-attivabili-GFP è una forma di GFP che è quasi invisibile dopo la sintesi, ma sviluppa forte verde (GFP) fluorescenza dopo l&#39;attivazione da 413 nm di luce laser e questo segnale è stabile per giorni 25,26. I costrutti che utilizzano paGFP sono stati utilizzati per dimostrare il traffico intralysosomal della proteina Lysosomal proteine ​​di membrana 1 (LAMP1) 25, la consegna superficie cellulare della stomatite virus vescicolare glicoproteina (VSVG, un marker di via secretoria) 27, e il fatturato dei perossisomi 28 e 29 autofagosomi. Per visualizzare lo smistamento di APP dal TGN in cellule vive, abbiamo progettato plasmide esprimente ultimi 112 amminoacidi di APP accoppiati a foto-attivabile (paGFP) sul terminale C (denominato βAPP-paGFP) 30. Abbiamo anche eseguito questi esperimenti con lunghezza APP e ha raggiunto risultati simili; il costrutto ΒAPP è usata qui perché fornisce immagini più luminose. Abbiamo poi photo disattivare &amp;# 946; APP-paGFP solo nel TGN, come delimitate dalla TGN marcatore galattosiltransferasi (GalT). Nonostante APP è stato taggato con paGFP di visualizzare un rapido trasporto assonale di APP e la clearance della regione perinucleare, questa è la prima dimostrazione di traffico di APP da un compartimento accuratamente definito ad un altro 11,31,32. Qui, dimostriamo accurata foto-attivazione entro il TGN e la fuoriuscita di APP in compartimenti a valle e la successiva scissione e liquidazione di lisosomi 30. L&#39;accurata fotoattivazione all&#39;interno del Golgi è ampiamente applicabile ad altri sistemi proteici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom culture dishes&#160;</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P-35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibutyrl cyclic AMP</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat in activated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Microscopy stage insert P</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempcontrol 37&#8211;2 digital 2-channel</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 63&#215; 1.4 numerical aperture oil immersion lens&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L685, 458&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565771</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholorquine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628&#160;</td>
			<td>dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1404</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>with colocalization package&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging the intracellular trafficking of app with photoactivatable gfp

Beta-amiloide (A?) È il principale costituente delle placche senili presenti nel cervello dei pazienti con malattia di Alzheimer. Ap deriva dalla scissione sequenziale di proteina precursore dell&#39;amiloide (APP) di β-secretasi e γ. Nonostante l&#39;importanza di Ap AD patologia, la localizzazione subcellulare di queste fratture non è ben stabilita. Lavorare nel nostro laboratorio e altri implicano il sistema endosomal / lisosomiale in processamento di APP dopo internalizzazione dalla superficie cellulare. Tuttavia, il traffico intracellulare di APP è relativamente poco studiato. Mentre le proteine ​​della superficie cellulare sono modificabili a molte tecniche di etichettatura, non ci sono metodi semplici per seguire il traffico di proteine ​​di membrana del Golgi. A tal fine, abbiamo creato costrutti APP che sono stati codificati con foto-attivabile GFP (paGFP) al C-terminale. Dopo la sintesi, paGFP ha bassa fluorescenza basale, ma può essere stimolato con 413 nm luce to produrre un forte, stabile fluorescenza verde. Usando il Golgi marcatore galactosyl transferasi accoppiato ad Cyan Fluorescent Protein (GalT-PCP) come un bersaglio, siamo in grado di precisione photoactivate APP nella rete trans-Golgi. Foto-activated APP-paGFP può quindi essere seguita come traffici di scomparti a valle identificati con fluorescente tagged proteine ​​marker vano per la precoce endosoma (Rab5), il compianto endosome (Rab9) e la lisosomi (LAMP1). Inoltre, utilizzando inibitori di processamento di APP tra cui la clorochina o γ-secretasi inibitore L685, 458, siamo in grado di effettuare esperimenti pulse-chase di esaminare il trattamento di APP in singole cellule. Troviamo che una grande frazione di APP si sposta rapidamente alla lisosomi senza apparire sulla superficie cellulare, e viene quindi eliminato dalla lisosomi da fratture secretasi-like. Questa tecnica dimostra l&#39;utilità della paGFP per seguire il traffico e la trasformazione delle proteine ​​intracellulari from il Golgi compartimenti a valle.

I risultati tipici mostrano βAPP lasciando TGN e sembra traffico rapidamente LAMP1 (Figura 1a e b). Durante il periodo di fotoattivazione, vescicole possono essere visti in partenza Golgi destinato lisosomi (Figura 1b). Senza trattamento inibitore, paGFP fluorescenza sarà visibile nei lisosomi, mentre vi è foto-attivazione nella TGN. Dopo l&#39;arresto fotoattivazione, il βAPP-paGFP viene rapidamente eliminato dal lisosomi (confrontare Figura 1a a <...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP at JoVE.com

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Mentre il trasporto delle proteine ​​di superficie cellulare è relativamente facile studiato, visualizzare il traffico di proteine ​​intracellulari è molto più difficile. Qui, usiamo costrutti incorporano GFP fotoattivabile e dimostrare un metodo per seguire con precisione la proteina precursore dell&#39;amiloide dal Golgi di down-stream scomparti e seguire il suo gioco.

Imaging il traffico intracellulare di APP con GFP fotoattivabile

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

imaging-the-intracellular-trafficking-of-app-with-photoactivatable-gfp

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Views.  Western University.  Mentre il trasporto delle proteine ​​di superficie cellulare è relativamente facile studiato, visualizzare il traffico di proteine ​​intracellulari è molto più difficile. Qui, usiamo costrutti incorporano GFP fotoattivabile e dimostrare un metodo per seguire con precisione la proteina precursore dell'amiloide dal Golgi di down-stream scomparti e seguire il suo gioco. 

Video: Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

Etichettatura hESC e hMSCs con nanoparticelle di ossido di ferro per i non-invasiva in vivo inseguimento con la RM

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Ricerca

Biologia

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Etichettatura Cellule staminali con le tinture fluorescenti per la rilevazione non invasiva con Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

Imaging funzionale del grasso bruno nei topi con FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Vivo Imaging delle proteine ​​GFP-etichettati in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gli oociti

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

Il pomodoro / GFP-FLP / FRT Metodo per Live Imaging del Mosaico adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; cellule fotorecettrici

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

Sintesi rapida e screening dei fattori di trascrizione attivati ​​chimicamente con i giornalisti a base di GFP-

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

Imaging di fluorescenza con One nanometri Precisione (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

In tempo reale Imaging di Pianta Dynamics cellulare con superficie variabile angolo epifluorescenza Microscopia

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...