We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).

ملاحظة: اتبع جميع الأنظمة المؤسسية بشأن الاستخدام الآمن والتخلص من المواد المشعة، بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر، واستخدام معدات الوقاية الشخصية، مثل القفازات، ونظارات السلامة، معطف المختبر، والدروع الاكريليك المناسبة. ملاحظة: يتكون عازلة معيار من 40 ملي HEPES-كوه، ودرجة الحموضة 7.5، 50 ملي الغلوتامات البوتاسيوم، 5 ملي DTT و 0.1 ملي EDTA (ومسبقة الصنع هذا المخزن المؤقت عند تركيز 5X) و 0.3 ملم من كل dNTP. ويتم تنقية البروتينات تكرار T7 كما هو موضح 8 و 9 و 10. الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد يحتوي على واحد T7 الموقع الاعتراف بريميز (5&#39;-GGGTC-3 &quot;، 5&#39;-GTGTC-3&quot;، 5&#39;-TGGTC-3 &#39;) يمكن شراؤها من مجموعة متنوعة من الشركات توليف الحمض النووي (طول وssDNA قد تعتمد على انزيم الاختيار، لبريميز T7، وهو مخموس هو الحد الأدنى لطول قالب لتجميع التمهيدي كامل طول 11، كما خفي C ضروري، ولكن إذا التمهيدي هو للتمديد من قبل البلمرة، يجب أن يكون النيوكليوتيدات إضافية موجودة في نهاية 3 &#39;من القالب. وبدأت ردود الفعل من خلال إضافة تركيز النهائي من 10 ملي MgCl 2 وحضنت عند 25 درجة مئوية. أخذ العينات اليدوية تعمل بشكل جيد لفترة نقاط من 5 ثوان أو أكثر. إذا كانت هناك حاجة للوقت نقطة أقصر من ذلك، فمن المستحسن استخدام أداة تدفق إخماد السريع للحصول على بيانات دقيقة. 1. متعددة دوران التمهيدي التجميعي رد الفعل من جانب أخذ العينات اليدوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل بدء التجربة، قسامة 2 ميكرولتر من العازلة صبغ الفورماميد (93٪ (ت / ت) الفورماميد، 50 ملي EDTA، 0.01٪ سيانول زايلين و 0.01٪ برموفينول الأزرق) إلى 8 1.5 أنابيب البولي بروبلين مل. بشكل عام، وعدد من الأنابيب هو مساو لعدد من الزمن نقاط تحليلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير خليط 20 ميكرولتر تتكون 1X العازلة، 0.1 ملي اعبي التنس المحترفين وCTP، 0.25 زارة التجارة والصناعة / مل [α- 32 ف] CTP، 0.1 ميكرومتر SSDقالب NA، و 0.1 ميكرومتر GP4 (معبرا عنها تركيز مسدوس - 0.6 ميكرومتر مونومر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 2 ميكرولتر من الخليط باستخدام pipettor وتخلط مع 2 ميكرولتر عازلة صبغ الفورماميد في أنبوب 1.5 مل أعدت في الخطوة 1.1 لأي ​​السيطرة على رد فعل (الساعة صفر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر من 0.1 M MgCl 2 إلى خليط التفاعل (لتركيز النهائي من 10 ملم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب يدويا 2 عينات ميكرولتر من خليط التفاعل باستخدام pipettor في الصورة فترات 10 وتخلط مع صبغ الفورماميد predispensed في أنابيب 1.5 مل أعدت في الخطوة 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في كتلة الحرارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل aliquots من العينات على هلام تغيير طبيعة. يتم حل المنتجات التمهيدي tetraribonucleotide صغيرة توليفها من قبل بريميز T7 جيدا على 0.4 مم 25٪ الأكريلاميد: bisacrylamide (19: 1)، 3 M اليوريا، 1X TBE (100 ملي تريس، بورات، 1 ملم EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجل بالكامل على chromatograورقة فيز والغطاء مع غلاف بلاستيكي. هلام الجافة باستخدام أكثر جفافا هلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد سلسلة تخفيف ما تبقى من خليط التفاعل وبقعة نفس حجم تحميلها على هلام على ورقة اللوني، أي بقعة 4 ميكرولتر من التخفيف إذا تم تحميل 4 ميكرولتر من العينة. ملاحظة: وهذا سيكون بمثابة منحنى القياسية لتحديد تركيز شكلت المنتجات أثناء عملية التفاعل. على سبيل المثال، التخفيفات خمسة أضعاف باستخدام العازلة TE (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA) تعمل بشكل جيد، تغطي مجموعة من 1:25 إلى 1: 15625 (5 2 -5 6)، ولكن يجب أن التخفيفات تعديلها تبعا لمستوى النشاط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح هلام الجافة ومستوى باستخدام شاشة phosphorimager. قياس النشاط الإشعاعي في سلسلة تخفيف وبناء منحنى القياسية كما هو موضح 8 و 12 ملاحظة: إدراج T7 البلمرة DNA لخليط التفاعل يسمح احد لإكساءمنجم استخدام بادئات tetraribonucleotide هذا الانزيم. على النحو الأمثل، وتركيز البلمرة يجب أن تشبع لتبسيط تفسير البيانات. وهناك تركيز البلمرة من 0.4 ميكرومتر أو أعلى يعطي نتائج جيدة. بالإضافة إلى ذلك، فإن تأثير بروتينات أخرى، مثل الحمض النووي ملزمة البروتينات واحدة الذين تقطعت بهم السبل، على أي توليف التمهيدي أو متخلفة حبلا بدء يمكن فحص بهذه الطريقة. </li></ol> 2. متعددة دوران التمهيدي التجميعي رد الفعل عن طريق صك السريع-إخماد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المخاليط رد فعل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 400 ميكرولتر من محلول A، التي تحتوي على العازلة 1X و 0.2 ميكرومتر GP4 مسدوس، 0.2 ميكرومتر قالب ssDNA، 0.6 ملي dNTPs، 0.2 ملي اعبي التنس المحترفين وCTP (بما في ذلك 0.5 MCI / مل [α- 32 ف] CTP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 400 ميكرولتر من محلول B، التي تحتوي على العازلة 1X و 20 ملي MgCl 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل-إخماد السريع أداة تدفق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل موسيقى الرابID-إخماد أداة التدفق. بعد ظهور القائمة الرئيسية، اكتب 7 على لوحة المفاتيح أداة لنقل سائق المحقنة إلى موقف البيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقنة موقف فتح عازلة ل&quot;تحميل&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المحاقن العازلة تحميل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق 10 مل حقنة تحتوي عازلة لميناء محرك حقنة. تغيير حقنة موقف مقبض الباب ل&quot;تحميل&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عن طريق الحقن 10 مل، وملء عازلة أداة خزان A و B مع 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.5، 1 ملم EDTA وملء حقنة C مع حل إخماد (250 ملي EDTA، و 0.2٪ SDS). إزالة فقاعات الهواء عن طريق دفع الغطاسون في الداخل والخارج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مواقف تغيير مقبض الباب ل&quot;النار&quot;. النوع 2 لضبط الموقف من شريط سائق حقنة. الصحافة .. &quot;تعديل أسفل&quot; الزر لخفض حقنة حتى يأتي عازلة خارج الحلقة الخروج: (7 تنخفض باستمرار؛ الخطوة 8 الكبيرة إلى أسفل؛ الخطوة 9 صغيرة أسفل). اكتب &quot;ESC&quot; للعودة إلى القائمة الرئيسية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأنابيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توريمنظمة العمل ضد الجوع خط الخروج إلى فراغ. تغيير المقابض عينة إلى &quot;إخراج&quot;. وثيقة حقنة عازلة عن طريق وضع المقابض إلى الوضع الأفقي. بدوره على فراغ وتراجع الحلقات 2 دافق في H 2 O لمدة 10 ثانية، ثم تراجع في MeOH لمدة 10 ثانية. حلقات الجافة ويمتص الهواء ل~ 15 ثانية، أو حتى تجف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات تحميل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقبض الباب تغير موقف عينة إلى &quot;تحميل&quot;. وضع حل لفي 1 مل حقنة. المكونات حقنة في واحدة من الموانئ تحميل عينة. كرر حل B، ووضع في المقابل ميناء التحميل العينة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع من الزمن نقاط <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في القائمة الرئيسية، اكتب 1 لتشغيل إخماد التدفق. أدخل وقت رد الفعل (الصورة) ثم اضغط على &quot;دخول&quot;. سيتم عرض عدد حلقة رد فعل للاستخدام. التبديل إلى حاجة حلقة رد فعل. إجراء غسل تكرار في الخطوة 2.2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل المقابض عينة إلى &quot;تحميل&quot;. يمزج رد فعل الحمل في الحلقات عينة حتى خارج المقصورة خلط المركزية. تحويل جميع المقابض إلى &quot;منطقة معلومات الطيرانE &quot;. تأكد من أن كافة المقابض هي في الموضع الصحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب 1.5 مل على نهاية الخروج الحلقة. اضغط على &quot;جو GO&quot; لتشغيل رد الفعل. إجراء غسل تكرار في الخطوة 2.2.4. تحديث الحقن عازلة A و B حتى ضربوا السائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 2.2.6.2-2.2.6.3 لكل نقطة الوقت المطلوب. استثناء: لا تقم بتحميل محلول يحتوي على بداية كاشف (أي MgCl 2 في هذه الحالة) عندما تبريد سيطرة الصفر الوقت نقطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء من جمع العينات، أدخل &quot;ESC&quot; للعودة إلى القائمة الرئيسية. اضغط على &quot;7&quot; للعودة سائق عازلة حقنة لموقف وطنه. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداة تنظيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المحاقن خليط التفاعل. تحويل عينة مقبض تحميل ل&quot;تحميل&quot; موقف. تحت فراغ، ويغسل كل حلقة العينة مع 10 مل من 0.2 هيدروكسيد الصوديوم N، تليها 10 مل 0.3 NH 3 ص 4 و 10 مل MeOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل المقابض حقنة ل&quot;تحميل&quot; موقف. اضغط لأسفل على كل SYR 3الغطاسون إنجي لاسترداد رد فعل وإخماد المخازن. غسل المحاقن مع 5 مل H 2 O مرتين على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الحقن مرة أخرى مع 5 مل H 2 O وتحويل المقابض إلى موقف &quot;النار&quot;. تغيير المواقف مقبض الباب وتشغيل فراغ لإزالة H 2 O. فلوش كما في الخطوة 2.2.4. إيقاف الصك. ويتم تحليل المنتجات كما هو موضح في الخطوات 1،7-1،12: ملاحظة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إضافة T7 الحمض النووي بوليميريز والبروتينات النسخ الأخرى في خليط التفاعل لتحليل تأثيرها على التوليف التمهيدي أو التمديد. </li></ol></li></ol> 3. وحيد دوران التمهيدي التجميعي رد الفعل ملاحظة: يتم إجراء أحادي دوران المقايسات التمهيدي تجميع / تمديد الخروج على نحو مماثل لردود فعل متعددة دوران، مع بعض الاختلافات الرئيسية: هذه المقايسات تتبع تحويل رديولبلد ATP إلى التمهيدي أو تمديد المنتجات، إلا أن تركيز ركائز والبروتينات هي consideraأعلى بلاي. وبالإضافة إلى ذلك، من أجل تحقيق حل ميلي ثانية واحدة للسماح للتحليل رد فعل التوليف التمهيدي، لا بد من الاستفادة من آلة التدفق إخماد السريع. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المخاليط رد فعل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 400 ميكرولتر من محلول A، التي تحتوي على العازلة 1X، 3 ميكرومتر مسدوس GP4، 6 ميكرومتر ssDNA القالب، 0.6 ملي dNTPs، 1 ملم CTP، و 2 نانومتر [γ- 32 ف] اعبي التنس المحترفين. إعداد 400 ميكرولتر من محلول B، التي تحتوي على العازلة 1X و 20 ملي MgCl 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سريع لإخماد عملية تدفق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفذ تفاعلات كما هو موضح في الخطوة 2.2. إذا رغبت في ذلك، إضافة البلمرة T7 الحمض النووي أو بروتين ملزمة T7 احد الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي عند تركيز من 15 ميكرومتر و 20 ميكرومتر، على التوالي. في هذه الحالة، والمنتجات تمديد تتراكم في نظام الوقت الذي يسمح لأخذ العينات اليدوية للتفاعل. </li></ol></li></ol> تحليل 4. البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب منحنيات تقدم المنتج لالأقل- غير الخطيةالساحات النماذج باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا قادرة على المربعات الصغرى نوبات و / أو التكامل العددي. فإن تفاصيل العملية تختلف مع البرنامج يعمل، ولكن أقل من أشكال معممة من المعادلات المستخدمة لتركيب البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد معدل تكوين المنتج من عدة تفاعلات التخليق دوران التمهيدي من المناسب للتقدم منحنيات لمعادلة خطية. إذا كان هناك انحناء كبير، استخدام طريقة معدل الأولي 13 و 14 عن طريق تركيب البيانات إلى وظيفة واحدة الأسي: ص = أ (ه - ك ر)، حيث ص هو تركيز المنتج، A هي السعة رد فعل، ك هو ثابت معدل لاحظ، ر حان الوقت، في ثوان. المنحدر من خط المماس في الوقت = 0 هو المعدل الأولي. ملاحظة: صالح قبل ثابتة تفاعلات التخليق التمهيدي الدولة لمعادلة خطية أو معادلة حالة ما قبل مستقرة انفجار ذ = A (ه - بو كRST ر) + معدل SS ر، حيث A هي السعة رد فعل، ك انفجار هو ثابت المعدل الملاحظ للانفجار حالة ما قبل ثابت، ومعدل ss غير أن حالة استقرار معدل SS = ك القط [أنزيم])، تي آن الأوان ، في ثوان. تناسب-دوران واحد تفاعلات التخليق التمهيدي منحنيات إلى وظيفة ذ = A واحد الأسي التقدم (ه - ك ر). في حالة GP4، تناسب البيانات عن طريق التكامل العددي 15، إلى نموذج مع ثلاث خطوات التكثيف NTP، حيث كل وسيطة هو في حالة توازن مع الانزيم، وذلك باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا. </li></ol>

<ol>
	<li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA replication. , (1992).</li><li>Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motors,+switches,+and+contacts+in+the+replisome.">Motors, switches, and contacts in the replisome.</a> Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).</li><li>Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+bacteriophage+T7+gene+4+proteins+in+providing+primase+and+helicase+functions+in+vivo.">Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).</li><li>Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+initiation+and+extension+by+T7+DNA+primase.">Primer initiation and extension by T7 DNA primase.</a> EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).</li><li>Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+architecture+of+the+bacteriophage+T7+primase+couples+RNA+primer+synthesis+to+DNA+synthesis.">Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis.</a> Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).</li><li>Kusakabe, T., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+4+DNA+primase+of+bacteriophage+T7+mediates+the+annealing+and+extension+of+ribo-oligonucleotides+at+primase+recognition+sites.">Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites.</a> J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).</li><li>Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+sequence-specific+template+binding+by+the+DNA+primase+of+bacteriophage+T7.">Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7.</a> Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).</li><li>Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+release+is+the+rate-limiting+event+in+lagging-strand+synthesis+mediated+by+the+T7+replisome.">Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides.">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li><li>Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+bacteriophage+T7+gene+2.5+protein.+A+single-stranded+DNA-binding+protein.">Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein.</a> J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+primases.">DNA primases.</a> Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).</li><li>Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+lysine+residues+in+the+RNA+polymerase+domain+of+the+gene+4+primase-helicase+of+bacteriophage+T7.">Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7.</a> J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).</li><li>Cao, W., De La Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+full+time+course+analysis+of+nonlinear+enzyme+cycling+kinetics.">Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics.</a> Sci Rep. 3, 2658 (2013).</li><li>Wang, M. H., Zhao, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+determining+kinetic+constants+of+complexing+inactivation+at+identical+enzyme+and+inhibitor+concentrations.">A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations.</a> FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer.">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+enzyme+kinetic+analysis,+1913.">A century of enzyme kinetic analysis, 1913.</a> FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).</li><li>Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG.">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).</li><li>Sanyal, G., Doig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+DNA+replication+enzymes+as+targets+for+antibacterial+drug+discovery.">Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

العامل الأكثر أهمية في أداء هذه التجارب هو توافر انزيم المنقى نشطة للغاية. خلال عملنا مع GP4، على سبيل المثال، وجدنا أن تخزين الإنزيم المنقى في المخزن (20 ملي فوسفات البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.4، 0.1 ملي EDTA، 1 ملم DTT) التي تحتوي على 50٪ الجلسرين في -20 درجة مئوية يؤدي إلى انخف?...

تكرار الحمض النووي هو ميزة الحفظ لجميع أشكال الحياة الخلوية. في حين هوية وعدد من مكونات النسخ المتماثل تختلف على نطاق واسع، ويشارك في الآليات العامة عبر تطور 1. هنا، نحن تصف والتجارب الحركية متقطعة القائم على هلام، وذلك باستخدام ركائز المشعة، التي تهدف إلى فهم حركية توليف الحمض النووي متخلفة حبلا في المختبر عن طريق مكونات جسيم مكرر T7. آلية تكرار T7 عاثية بسيطة جدا، تتكون من البروتينات أربعة فقط (بوليميريز الحمض النووي، GP5، وعامل processivity لها، كولاي thioredoxin، وGP4-بريميز هيليكاز bifunctional، وبروتين DNA واحد الذين تقطعت بهم السبل ملزم، GP2. 5) 2. هذه الميزة تجعل من نظام نموذجا جذابا لدراسة الآليات البيوكيميائية الحفظ تشارك في تكرار الحمض النووي. ويتم التركيز بشكل خاص على تشكيل الاشعال ريبونوكليوتيد التي كتبها T7 الحمض النووي بريميز، وهو حرجةخطوة لتر في الشروع في تركيب الحمض النووي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن ينظر أيضا في استخدام هذه البادئات من قبل البلمرة T7 الحمض النووي أو البروتينات النسخ الأخرى عن طريق إشراكها في خليط التفاعل. وT7 بريميز-هيليكاز، GP4، يحفز تشكيل الاشعال لتخليق الحمض النووي في تسلسل الحمض النووي محددة تسمى المواقع الاعتراف بريميز، أو استراتيجية الحد من الفقر، (5&#39;-GTC-3 &#39;). والسيتوزين في استراتيجية الحد من الفقر هو خفي، فمن الضروري للاعتراف الموقع، ولكن لا يتم نسخ ذلك في المنتج 3. الخطوة الأولى في التوليف التمهيدي من GP4 تتضمن تشكيل ثنائي النوكليوتيد pppAC، التي امتدت بعد ذلك لأرتب، وفي نهاية المطاف إلى الاشعال رباعي النوكليوتيد الوظيفية pppACCC، pppACCA، أو pppACAC تبعا لتسلسل في قالب 4. ويمكن بعد هذه الاشعال يتم استخدامها من قبل البلمرة T7 الحمض النووي للشروع في تركيب الحمض النووي، والذي هو أيضا عملية بمساعدة GP4 5، 6. في هذا الصدد، وبريميزنطاق استقرار tetraribonucleotides قصيرة للغاية مع القالب، ومنع التفكك، ويشارك البلمرة DNA بطريقة تؤدي إلى تأمين التمهيدي / القالب إلى موقع نشط 7 البلمرة. وتتكرر هذه الخطوات (RNA التوليف التمهيدي، عمليتي التحول التمهيدي لالبلمرة، والإرشاد) في دورات متعددة لتكرار حبلا متخلفة ويجب أن ينسق مع تكرار حبلا الرائدة. المقايسات الموصوفة هنا هي حساسة للغاية، ويمكن أداؤها في إطار زمني المعتدل. ومع ذلك، فهي نسبيا منخفضة الإنتاجية وعناية كبيرة يجب أن تمارس في الاستخدام والتخلص من المواد المشعة. اعتمادا على السرعة التي حصيلة التفاعل، يمكن للمرء أن يستخدم أداة لإخماد السريع لتحقيق العينات في فترات زمنية قابلة للتحليل مغزى من الدورات وقت رد الفعل إما في ثابت أو دولة ما قبل مستقرة. في الآونة الأخيرة، استخدمنا المقايسات وصفها هنا لتقديم evidenc(ه) من أهمية إطلاق التمهيدي من المجال بريميز من GP4 في بدء شظايا أوكازاكي. بالإضافة إلى ذلك، وجدنا دليلا على وجود دور تنظيمي لالحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل T7 البروتين، gp2.5 ملزمة، في تعزيز تشكيل التمهيدي كفاءة واستخدام 8.

<table><tbody><tr><td>Tris pre-set crystals&lt;br/&gt; pH 7.5</td><td>SIGMA</td><td>T4128</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>SIGMA</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td><td>SIGMA</td><td>G1501&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>J.T. Baker</td><td>F780-02</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>MP Biomedicals</td><td>811030</td><td></td></tr><tr><td>(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4931-04</td><td></td></tr><tr><td>[&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] CTP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU508H</td><td>radioactive, take protective measures</td></tr><tr><td>[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td>radioactive, take protective measures</td></tr><tr><td>100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&amp;nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>77100</td><td>four dNTPs part of set</td></tr><tr><td>100 mM ATP and CTP</td><td>Epicentre</td><td>RN02825</td><td>part of NTP set</td></tr><tr><td>ssDNA constructs</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>custom sequences&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>methanol&amp;nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3017-08</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>SIGMA</td><td>B8026&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cylene xyanol&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>X4126&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>acrylamide</td><td>SIGMA</td><td>A9099</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Methylenebisacrylamide</td><td>SIGMA</td><td>M7279&amp;nbsp;</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>2549</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Quench-Flow Instrument&amp;nbsp;</td><td>Kintek Corp.</td><td>RQF-3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Explorer</td><td>Kintek Corp.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph&amp;nbsp;</td><td>Synergy Software</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

kinetics of lagging-strand dna synthesis in vitro by the bacteriophage t7 replication proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

وقد تم الحصول على النتائج الموضحة في الشكل 1A كما هو موضح في الخطوة 1 من البروتوكول، أي عن طريق أخذ عينات رد فعل التوليف التمهيدي يحفزه GP4 في ظل ظروف متعددة دوران يدويا. هنا، مجموعة واسعة من المنتجات بعد الكهربائي للهلام يمكن مل?...

Watch this Scientific Journal Video about Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins at JoVE.com

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

حركية توليف الحمض النووي متخلفة حبلا<em&gt; في المختبر</em&gt; من البروتينات النسخ المتماثل الجراثيم T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

kinetics-lagging-strand-dna-synthesis-vitro-bacteriophage-t7

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Replication

SCIENTISTS IN ACTION

7.3K Views.  Harvard Medical School. We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7. 

Video: Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. The binding of prokaryotic DnaG-like primases to DNA occurs at a specific trinucleotide recognition sequence. It is a pivotal step in the formation of Okazaki fragments. Conventional biochemical tools that are used to determine the DNA recognition sequence of DNA primase provide only limited information. Using a high-throughput microarray-based binding assay and consecutive biochemical analyses, it has been shown that 1) the specific binding context (flanking sequences of the recognition site) influences the binding strength of the DNA primase to its template DNA, and 2) stronger binding of primase to the DNA yields longer RNA primers, indicating higher processivity of the enzyme. This method combines PBM and primase activity assay and is designated as high-throughput primase profiling (HTPP), and it allows characterization of specific sequence recognition by DNA primase in unprecedented time and scalability.&#160;

Protein binding microarray (PBM) experiments combined with biochemical assays link the binding and catalytic properties of DNA primase, an enzyme that synthesizes RNA primers on template DNA. This method, designated as high-throughput primase profiling (HTPP), can be used to reveal DNA-binding patterns of a variety of enzymes.

الحمض النووي الاعتراف تسلسل بواسطة الحمض النووي البدائي باستخدام عاليه الانتاجيه البدائية التنميط

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Biochemistry

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biology

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

الملاحظة المباشرة من الحمض النووي الانزيمات تكرار استخدام الحمض النووي جزيء واحدة تمتد الفحص

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA polymerase (RNAP) following a head-on collision is unknown. Here, we find that the E. coli replisome stalls upon collision with a head-on transcription complex, but instead of collapsing, the replication fork remains highly stable and eventually resumes elongation after displacing the RNAP from DNA. We also find that the transcription-repair coupling factor, Mfd, promotes direct restart of the fork following the collision by facilitating displacement of the RNAP. These findings demonstrate the intrinsic stability of the replication apparatus and a novel role for the transcription-coupled repair pathway in promoting replication past a RNAP block.

The fate of the replisome following a collision with a head-on RNA polymerase (RNAP) is unknown. We find that the replisome stalls upon collision with a head-on RNAP, but resumes elongation after displacing the RNAP from DNA. Mfd promotes replication restart by facilitating displacement of the RNAP after the collision.

إعادة تشغيل مباشرة من شوكة المتماثل المتوقفة من قبل بوليميريز الحمض النووي الريبي هيد اون

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

توليف "باكتيريوفاجيس المعدية" في كولاي-استناداً إلى "نظام التعبير" الخلية الحرة

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Bioengineering

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a fluorescence-based approach to quantify DNA, and here, it is adapted to quantify phage genomes as a proxy for phage particles. In this protocol, a facile phage DNA preparation method is described using high-temperature heating without additional DNA purification. The method only needs small volumes of heat-treated phages and small volumes of the qPCR reaction. qPCR is high-throughput and fast, able to process and obtain data from a 96-well plate of reactions in 2&#8211;4 h. Compared to other phage enumeration approaches, qPCR is more time-efficient. Here, qPCR is used to enumerate T7 phages identified from biopanning against in vitro cystic fibrosis-like mucus model. The qPCR method can be extended to quantify T7 phages from other experiments, including other types of biopanning (e.g.,&#160;immobilized protein binding, in vivo phage screening) and other sources (e.g., water systems or body fluids). In summary, this protocol can be modified to quantify any DNA-encapsulated viruses.

A reproducible, accurate, and time efficient quantitative PCR (qPCR) method to enumerate T7 bacteriophage is described here. The protocol clearly describes phage genomic DNA preparation, PCR reaction preparation, qPCR cycling conditions, and qPCR data analysis.

PCR الكمي من عاثية T7 من بيوبانينج

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Immunology and Infection

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of oligonucleotides in biotechnology and synthetic biology. Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates have historically been prepared in vitro by enzymatic methods. However, these methods are limited to natural RNA oligonucleotides, have strong sequence preferences, and tend to produce heterogeneous products. New methods of chemical triphosphorylation complement both the reduced cost of automated oligonucleotide synthesis by phosphoramidite chemistry and the diverse range of nucleotide modifications now available. Thus, the synthesis of oligonucleotide triphosphates of arbitrary sequence and length, and optionally containing various nonnatural modifications, is now accessible.
This paper presents the appropriate methods and techniques for chemical triphosphorylation of oligonucleotides using salicyl phosphorochloridite and pyrophosphate. This method uses commercially available reagents, is compatible with most oligonucleotides prepared by standard solid-phase synthesis methods, and can be completed in 2 h following oligonucleotide synthesis, before deprotection and purification. Two uses of chemically triphosphorylated oligonucleotides as substrates for catalytic RNA enzymes are demonstrated, including the synthesis of a mirror-image version of the hammerhead ribozyme from nonbiological L-RNA triphosphates.

Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates are ubiquitous components in essential biological pathways and have seen increasing use in biotechnology applications. Here, we describe techniques for the routine synthesis and purification of oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates, starting from oligonucleotides prepared by standard automated synthesis techniques.

الفسفرة الثلاثية الكيميائية لأوليغونوكليوتيدات

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

استكشاف ديناميكيات بكتيريا عاثيات الأمعاء في نماذج الفئران باستخدام T4 Phage

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across all known ecosystems. Within bacterial communities, such as those found in the gut microbiota, phages are implicated in regulating microbiota population dynamics and driving bacterial evolution. There has been renewed interest in phage research in the last decade, in part due to the host-specific killing capabilities of lytic phages, which offer a promising tool to counter the increasing threat of antimicrobial resistant bacteria. Furthermore, recent studies demonstrating that phages adhere to intestinal mucus suggest they may have a protective role in preventing bacterial invasion into the underlying epithelium. Importantly, like bacterial microbiomes, disrupted phageomes have been associated with worsened outcomes in diseases such as inflammatory bowel disease. Previous studies have demonstrated that phages can modulate the microbiome of animals and humans through fecal filtrate transplants, benefiting the host&#39;s health. With this recent wave of research comes the necessity to establish and standardize protocols for studying phages in the context of the gut microbiome. This protocol provides a set of procedures to study isolated T4 phages and their bacterial host, Escherichia coli,&#160;in the context of the murine gastrointestinal tract. The methods described here outline&#160;how to start from a phage lysate, administer it to mice and assess effects on bacterial host and phage levels.&#160;This protocol can be modified and applied to other phage-bacterial pairs and provides a starting point for studying host-phage dynamics in vivo.

تسليط الضوء على المؤلف: التحقيق في الاستجابات المناعية التي تسببها البكتيريا في الفئران gnotobiotic

Bacteriophages (phages), viruses that infect bacteria, are an integral component of the gut microbiome. Though these symbiotic inhabitants drive bacterial fitness and population dynamics, little is understood about how they impact gut homeostasis and disease. This protocol studies isolated T4 phages within a mouse model, adaptable to other phage-bacterial pairs.

تفاعل البكتيريا T4 والإشريكية القولونية في أمعاء الفئران: نموذج نموذجي لدراسة ديناميكيات البكتيريا المضيفة في الجسم الحي

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

حركية توليف الحمض النووي متخلفة حبلا

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

الحمض النووي الاعتراف تسلسل بواسطة الحمض النووي البدائي باستخدام عاليه الانتاجيه البدائية التنميط

تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

الملاحظة المباشرة من الحمض النووي الانزيمات تكرار استخدام الحمض النووي جزيء واحدة تمتد الفحص

إعادة تشغيل مباشرة من شوكة المتماثل المتوقفة من قبل بوليميريز الحمض النووي الريبي هيد اون

توليف "باكتيريوفاجيس المعدية" في كولاي-استناداً إلى "نظام التعبير" الخلية الحرة

PCR الكمي من عاثية T7 من بيوبانينج

الفسفرة الثلاثية الكيميائية لأوليغونوكليوتيدات

تفاعل البكتيريا T4 والإشريكية القولونية في أمعاء الفئران: نموذج نموذجي لدراسة ديناميكيات البكتيريا المضيفة في الجسم الحي

تفاعل البكتيريا T4 والإشريكية القولونية في أمعاء الفئران: نموذج نموذجي لدراسة ديناميكيات البكتيريا المضيفة في الجسم الحي

تفاعل البكتيريا T4 والإشريكية القولونية في أمعاء الفئران: نموذج نموذجي لدراسة ديناميكيات البكتيريا المضيفة في الجسم الحي