Name: kinetics of lagging-strand dna synthesis in vitro by the bacteriophage t7 replication proteins
Uploaded: 2017-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins at JoVE.com

We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).

HINWEIS: Befolgen Sie alle institutionellen Bestimmungen für die sichere Verwendung und Entsorgung von radioaktivem Material, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Verwendung persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhe, Schutzbrille, Kittel und entsprechende Acryl Schilde. HINWEIS: Der Standardpuffer besteht aus 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM Kaliumglutamat, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA (dieser Puffer wird bei einer 5-fach Konzentration vorgefertigten) und 0,3 mM jedes dNTP. T7 - Replikationsproteine werden gereinigt , wie beschrieben 8, 9, 10. Einzelsträngige DNA eine einzelne T7 Primase-Erkennungsstelle (5&#39;-GGGTC-3 &#39;, 5&#39;-GTGTC-3&#39;, 5&#39;-TGGTC-3 &#39;) enthält, kann aus einer Vielzahl von DNA-Synthese Unternehmen erworben werden (die Länge die ssDNA auf das Enzym der Wahl abhängen, für T7 - Primase, ein Pentamer der minimale Schablonenlänge für ein Volllängen - Primers zu synthetisieren 11, wie die kryptische C wesentlich ist jedoch, wenn der Primer durch die Polymerase verlängert werden soll, müssen zusätzliche Nucleotide am 3&#39; - Ende der Matrize vorhanden sein. Reaktionen werden durch die Zugabe einer Endkonzentration von 10 mM MgCl 2 und inkubiert bei 25 ° C eingeleitet. Manuelle Probenahme funktioniert gut für die Zeitpunkte von 5 Sekunden oder länger. Wenn Zeitpunkten kürzer ist als die erforderlich sind, wird empfohlen, ein rapid-quench Strömungs Instrument zu verwenden, um genaue Daten zu erhalten. 1. Multiple-Umsatz Primer Synthesereaktion durch manuelle Probenahme <ol><li> Vor dem Start des Experiments Aliquot 2 ul Formamid-Farbstoff-Puffer (93% (v / v) Formamid, 50 mM EDTA, 0,01% Xylolcyanol und 0,01% Bromphenol blau) in 8 1,5 ml Polypropylenröhrchen. Im Allgemeinen ist die Anzahl der Rohre gleich der Anzahl von Zeitpunkten analysiert. </li><li> Bereiten Sie eine 20 &amp; mgr; l Mischung aus 1x Puffer, 0,1 mM ATP und CTP, 0,25 mCi / ml [α- 32 P] CTP, 0,1 uM ssDNA Vorlage, und 0,1 uM gp4 (als Hexamer Konzentration ausgedrückt - 0,6 &amp; mgr; M-Monomer). </li><li> Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Entfernen 2 &amp; mgr; l der Mischung ein Pipettiergerät und mischen sich mit 2 ul Formamid-Farbstoff Puffer in einem 1,5 ml-Röhrchen in Schritt unter Verwendung von 1,1 für die keine Reaktionskontrolle (Zeit Null). </li><li> Fügen Sie 2 ul 0,1 M MgCl 2 auf die Reaktionsmischung (auf eine Endkonzentration von 10 mM). </li><li> zurückziehen manuell 2 &amp; mgr; l-Proben der Reaktionsmischungen eine Pipette in 10 s Intervallen und mischen sich mit Formamid Farbstoff vordosiert in 1,5 ml-Röhrchen, hergestellt in Schritt 1.1 verwendet. </li><li> Wärme Proben bei 95 ° C für 5 min in einem Heizblock. </li><li> Laden Aliquots der Proben auf einem denaturierenden Gel. Die kleinen tetraribonucleotide Primer Produkte von der T7-Primase synthetisiert sind auf einer 0,4 mm dicken 25% Acrylamid gelöst: Bisacrylamid (19: 1), 3 M Harnstoff, 1x TBE (100 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA). </li><li> Legen gesamte Gel auf chromatograPHY Papier und Abdeckung mit Plastikfolie. Trockenes Gel mit einem Gel-Trockner. </li><li> Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe der Rest des Reaktionsgemisches und Spot das gleiche Volumen auf dem Gel auf Chromatographie Papier eingelegt, das heißt, vor Ort 4 ul der Verdünnung , wenn 4 ul der Probe geladen wurden. ANMERKUNG: Diese als Standardkurve dient der Konzentration der Produkte während der Reaktion gebildet zu bestimmen. Zum Beispiel fünffache Verdünnungen TE Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) funktionieren gut, eine Reihe von 01.25 Spanning bis 1: 15.625 (5 2 -5 6), aber die Verdünnungen sollten in Abhängigkeit von dem Aktivitätsniveau eingestellt werden. </li><li> Expose trockenes Gel und Standard mit einem Phosporimager Bildschirm. Quantifizierung der Radioaktivität in der Verdünnungsreihe und konstruieren als eine Standardkurve 8 beschrieben, 12 HINWEIS: Inclusion von T7 DNA - Polymerase zu der Reaktionsmischung ermöglicht es , zu EXAMine die Verwendung von tetraribonucleotide Primer durch dieses Enzym. Optimalerweise sollte die Polymerase-Konzentration werden Sättigen der Interpretation der Daten zu vereinfachen. Eine Polymerase-Konzentration von 0,4 &amp; mgr; M oder höher gute Ergebnisse. Zusätzlich kann die Wirkung von anderen Proteinen, wie beispielsweise Einzelstrang-DNA-bindende Proteine, entweder auf der Primersynthese oder nacheilend Stranginitiations kann auf diese Weise untersucht werden. </li></ol> 2. Multiple-Umsatz Primer Synthesereaktion einem Rapid-Quench Einsatz des Instruments <ol><li> Herstellung von Reaktionsgemischen <ol><li> Bereiten 400 ul Lösung A, enthaltend 1x Puffer, 0,2 &amp; mgr; M gp4 Hexamer, 0,2 uM ssDNA Vorlage, 0,6 mM dNTPs, 0,2 mM ATP und CTP (einschließlich 0,5 mCi / ml [α- 32 P] CTP. </li><li> Bereiten 400 ul Lösung B, enthaltend 1x Puffer und 20 mM MgCl 2. </li></ol></li><li> Der Betrieb von S-Quench Fluss Instrument <ol><li> Schalten Sie Rapid-Quench-Flow Instruments; nachdem das Hauptmenü angezeigt wird, geben 7 auf dem Instrument Tastatur, um die Spritze Fahrer in die Ausgangsposition zu bewegen. </li><li> Offene Pufferspritzenposition auf &quot;LOAD&quot;. </li></ol></li><li> Ladepuffer Spritzen <ol><li> Bringen Sie einen 10-ml-Spritze mit dem Antriebs Spritze Port mit Puffer. Ändern Spritze Knopfposition auf &quot;LOAD&quot;. </li><li> Unter Verwendung von 10 ml Spritzen, füllen Instrument Pufferbehälter A und B mit 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA und Spritze C mit Quench-Lösung (250 mM EDTA und 0,2% SDS) zu füllen. Entfernen Sie Luftblasen durch Drücken Kolben, die in die und aus. </li><li> Ändern Knopfpositionen auf &quot;FIRE&quot;. Typ-2-Position der Spritze Fahrer bar einzustellen. Drücken Sie &quot;EINSTELLUNG VERRINGERN&quot;, um die Spritze zu senken, bis Puffer aus der Austrittsschleife kommt: (7-geht kontinuierlich; 8-großen Schritt nach unten; 9-kleiner Schritt nach unten). Geben Sie &quot;ESC&quot;, um in das Hauptmenü zurückzukehren. </li></ol></li><li> Wash Schlauch <ol><li> AttACH Ausfahrt Linie Vakuum. Ändern Probe Knöpfe auf &quot;flush&quot;. Schließen Puffer Spritze durch die Knöpfe in die horizontale Position. Schalten Sie Vakuum und tauchen Sie die 2 bündig Schleifen in H 2 O für 10 s, dann tauchen in MeOH für 10 s. Trockenschleifen von Luft für ~ 15 s saugen, oder bis es trocken ist. </li></ol></li><li> Laden Proben <ol><li> Ändern Probe Knopfposition auf &quot;LOAD&quot;. Legen Sie die Lösung A in 1-ml-Spritze. Stecken Spritze in einem der Probenladestationen. Wiederholen Sie dies für die Lösung B, und legen Sie in die entgegengesetzte Probenladeöffnung. </li></ol></li><li> Sammlung von Zeitpunkten <ol><li> Auf dem Hauptmenü, geben Sie 1 für Quench-Flow-Lauf. Geben Sie Reaktionszeit (s) ein und drücken Sie &quot;ENTER&quot;. Die Reaktionsschleife Nummer verwendet wird angezeigt. Wechseln Sie auf die gewünschte Reaktionsschleife. Wiederholen Waschvorgang in Schritt 2.2.4. </li><li> Drehen Probe Knöpfe auf &quot;LOAD&quot;. Last Reaktion mischt in Probenschleifen bis kurz außerhalb des zentralen Mischraum. Drehen Sie alle Regler auf &quot;FIRE &quot;. Bestätigen Sie, dass alle Knöpfe in der richtigen Position sind. </li><li> Legen Sie 1,5 ml-Röhrchen auf Ende der Ausfahrt Schleife. Drücken Sie auf &quot;GO&quot; um die Reaktion auszuführen. Wiederholen Waschvorgang in Schritt 2.2.4. Nachladepuffer Spritzen A und B, bis sie den Fahrer getroffen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2.6.2-2.2.6.3 für jeden gewünschten Zeitpunkt. Ausnahme: Legen Sie keine Lösung , um die Start - Reagenz (dh MgCl 2 in diesem Fall) , wenn das Abschrecken des Null - Zeit-Punkt - Regelung enthält. </li><li> Wenn die Proben fertig zu sammeln, geben Sie &quot;ESC&quot; zum Hauptmenü zurückzukehren. Drücken Sie &quot;7&quot; Puffer Spritze Fahrer in seine Ausgangsposition zurückzukehren. </li></ol></li><li> Instrument clean-up <ol><li> Entfernen Reaktionsgemisch Spritzen. Drehen Probenladeknopf auf &quot;LOAD&quot; Position. Im Vakuum waschen jede Probenschleife mit 10 ml 0,2 N NaOH, gefolgt von 10 ml 0,3 NH 3 PO 4 und 10 ml MeOH. </li><li> Drehen Sie Spritze Knöpfe auf &quot;LOAD&quot; Position. Drücken Sie auf allen 3 syringe Plunger Reaktion und Quench-Puffer abzurufen. Waschen Sie die Spritzen mit 5 ml H 2 O mindestens zweimal. </li><li> Füllen Sie Spritzen erneut mit 5 ml H 2 O und drehen Knöpfe auf &quot;FIRE&quot; Position. Ändern Sie Knopfpositionen und schalten Sie Vakuum zu H 2 O Flush , wie in Schritt 2.2.4 entfernen. Schalten Sie das Gerät ab. HINWEIS: Die Produkte werden in Schritten von 1,7 bis 1,12 , wie beschrieben analysiert. Zusätzlich Polymerase T7 DNA und andere Replikationsproteine ​​können in der Reaktionsmischung hinzugefügt werden, deren Wirkung auf der Primersynthese oder Erweiterung zu analysieren. </li></ol></li></ol> 3. Single-Umsatz Primer Synthesereaktion HINWEIS: Single-Umsatz Primersynthese / Extension - Assays sind in ähnlicher Weise zu Mehrumsatz Reaktionen durchgeführt, mit einigen großen Unterschiede: diese Tests folgen die Umwandlung von radiomarkiertem ATP in Primer oder Verlängerungsprodukte, aber die Konzentration von Substraten und Proteinen sind consideraBly höher. Darüber hinaus, um Millisekundenauflösung zu ermöglichen Analyse der Primer-Synthesereaktion zu erreichen, muss man eine schnelle Abschrecken Strömungsmaschine zu nutzen. <ol><li> Herstellung der Reaktionsgemische. <ol><li> Bereiten Sie 400 ul der Lösung A, bestehend aus 1x Puffer, 3 uM gp4 Hexamer, 6 uM ssDNA - Vorlage, 0,6 mM dNTPs, 1 mM CTP und 2 nM [γ- 32 P] ATP. Bereiten 400 ul Lösung B, enthaltend 1x Puffer und 20 mM MgCl 2. </li></ol></li><li> Schneller-Quench Flow - Betrieb <ol><li> Führen Sie Reaktionen wie in Schritt 2.2 beschrieben. Falls gewünscht, fügen T7 DNA-Polymerase oder T7 einzelsträngige DNA-Bindungsprotein in einer Konzentration von 15 uM und 20 uM, respectively. In diesem Fall sammeln sich die Verlängerungsprodukte zu einem Zeitpunkt Regime, das für die manuelle Probennahme der Reaktions ermöglicht. </li></ol></li></ol> 4. Datenanalyse <ol><li> Fit Produkt Verlaufskurven auf nicht-lineare LeastQuadrate Modelle im Handel erhältliche Software, die der kleinsten Quadrate passt und / oder numerische Integration verwendet wird. Die Einzelheiten der Operation wird mit der Software verwendet wird, variieren, aber unterhalb sind verallgemeinerte Formen der Gleichungen verwendet, um die Daten passen. </li><li> Bestimmen die Rate der Produktbildung mehrerer Umsatz Primer Synthesereaktionen von Anpassungskurven in eine lineare Gleichung für den Fortschritt. Bei wesentlichen Krümmung ist, verwenden Sie die Anfangsgeschwindigkeit Methode 13, 14 durch die Daten in eine Single-Exponentialfunktion passend: y = A (e - k t), wobei y die Produktkonzentration ist, A die Reaktions Amplitude, k die beobachtete Geschwindigkeitskonstante, t die Zeit in Sekunden. Die Steigung der Tangente zum Zeitpunkt = 0 ist die Anfangsgeschwindigkeit. HINWEIS: Fit pre-steady state Primer Synthesereaktionen auf eine lineare Gleichung oder dem Ober steady state Burst Gleichung y = A (e - k burst t) + Rate ss t, wobei A die Reaktions Amplitude, k Burst ist die beobachtete Geschwindigkeitskonstante für die Pre-Steady - State - Burst - Rate ss ist die Steady-State - Rate ss = k cat [Enzym]), t die Zeit , in Sekunden. Fit Einzel Umsatz Primer Synthesereaktionen Verlaufskurven auf einer Single-Exponentialfunktion y = A (e - k t). Im Falle von gp4, passen die Daten durch numerische Integration 15 zu einem Modell mit drei NTP Kondensationsschritten, wobei jeder Zwischen in Gleichgewicht mit dem Enzym ist, im Handel erhältliche Software. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Der wichtigste Faktor, diese Experimente in der Durchführung ist die Verfügbarkeit von hoch aktiven gereinigten Enzyms. Während unserer Arbeit mit gp4 zum Beispiel haben wir festgestellt, dass die Lagerung des gereinigten Enzyms in Puffer (20 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT), enthaltend 50% Glycerin bei -20 ° C führt zu einer Reduktion in die spezifische Aktivität des Präparats über einige Monate. Daher wir nun Flash-freeze kleinen Aliquots von gereinigtem gp4 in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM Na...

Die Replikation der DNA ist ein konserviertes Merkmal aller zellulären Lebens. Während die Identität und Anzahl der Replikationskomponenten in weiten Grenzen variieren, werden die allgemeinen Mechanismen für die Evolution 1 geteilt. Hier beschreiben wir Gelbasis, diskontinuierliche kinetischen Experimenten, radioaktiven Substraten, dem Ziel, das Verständnis der Kinetik der nacheilenden Strang - DNA - Synthese in vitro durch Komponenten des T7 replisome. Die Replikationsmaschinerie des Bakteriophagen T7 ist sehr einfach, die aus nur vier Proteine (die DNA - Polymerase, GP5 und dessen Prozessivitätsfaktor, E. coli - Thioredoxin, die bifunktionellen Primase-Helikase gp4 und die einzelsträngige DNA - Bindungsprotein, GP2. 5) 2. Diese Funktion macht es ein attraktives Modellsystem die konservierten biochemischen Mechanismen der DNA-Replikation beteiligt zu studieren. Ein besonderer Schwerpunkt liegt auf der Bildung von Ribonukleotid Primer durch T7-DNA-Primase platziert, ein critical Schritt bei der Initiation der DNA-Synthese. Darüber hinaus kann man auch die Verwendung dieser Primer durch T7-DNA-Polymerase oder andere Replikationsproteine ​​zu untersuchen, indem sie in der Reaktionsmischung einschließlich. Die T7-Primase-Helikase, gp4, katalysiert die Bildung von Primer für DNA-Synthese an spezifische DNA-Sequenzen Primase-Erkennungsstellen oder PRS genannt, (5&#39;-GTC-3 &#39;). Das Cytosin in der PRS ist kryptisch, es für die Anerkennung der Website von wesentlicher Bedeutung ist, aber es wird nicht in das Produkt 3 kopiert. Der erste Schritt bei der Primersynthese durch gp4 beinhaltet die Bildung des Dinucleotid pppAC, die dann zu einem Trimer verlängert wird, und schließlich zu funktionellen Tetranukleotid Primern pppACCC, pppACCA oder pppACAC Abhängigkeit von der Sequenz in der Template - 4. Diese Primer können dann von T7 DNA - Polymerase verwendet werden , um DNA - Synthese zu initiieren, das auch ein gp4 unterstütztes Verfahren 5, 6. In dieser Hinsicht ist die PrimaseDomäne stabilisiert die extrem kurze tetraribonucleotides mit der Vorlage ihrer Dissoziation zu verhindern, greift DNA - Polymerase tatsächlich in einer Weise , um die Primer / Matrize in der Polymerase - aktiven Stelle 7 sichern. Diese Schritte (RNA-Primer-Synthese, Primer-Handoff-Polymerase und Verlängerung) werden in mehreren Zyklen wiederholt, um die nacheilende Strang zu replizieren und mit der Replikation des führenden Stranges koordiniert werden. Die Assays hier beschrieben sind, sind sehr empfindlich und kann in einem moderaten Zeitrahmen durchgeführt werden. Sie sind jedoch mit relativ niedrigem Durchsatz und großer Sorgfalt muss bei der Nutzung und Entsorgung von radioaktiven Materialien ausgeübt werden. In Abhängigkeit von der Geschwindigkeit, mit der die Reaktion abläuft, könnte man ein schnelles Abschrecken Instrument einsetzen, um Proben auf Zeitskalen zugänglich für aussagekräftige Analyse der Kurse Reaktionszeit erreichen entweder die stationäre oder die Pre-stabilen Zustand. Vor kurzem haben wir verwendeten Assays hier beschriebenen evidenc zur Verfügung zu stellene die Bedeutung der Primer Freisetzung aus der Primase-Domäne von gp4 in der Einleitung von Okazaki-Fragmenten. Zusätzlich fanden wir Beweise für eine regulatorische Rolle für die T7 einzelsträngige DNA - Bindungsprotein, gp2.5, bei der Förderung der effizienten Primer Bildung und Nutzung 8.

<table><tbody><tr><td>Tris pre-set crystals&lt;br/&gt; pH 7.5</td><td>SIGMA</td><td>T4128</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>SIGMA</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td><td>SIGMA</td><td>G1501&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>J.T. Baker</td><td>F780-02</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>MP Biomedicals</td><td>811030</td><td></td></tr><tr><td>(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4931-04</td><td></td></tr><tr><td>[&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] CTP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU508H</td><td>radioactive, take protective measures</td></tr><tr><td>[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td>radioactive, take protective measures</td></tr><tr><td>100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&amp;nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>77100</td><td>four dNTPs part of set</td></tr><tr><td>100 mM ATP and CTP</td><td>Epicentre</td><td>RN02825</td><td>part of NTP set</td></tr><tr><td>ssDNA constructs</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>custom sequences&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>methanol&amp;nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3017-08</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>SIGMA</td><td>B8026&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cylene xyanol&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>X4126&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>acrylamide</td><td>SIGMA</td><td>A9099</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Methylenebisacrylamide</td><td>SIGMA</td><td>M7279&amp;nbsp;</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>2549</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Quench-Flow Instrument&amp;nbsp;</td><td>Kintek Corp.</td><td>RQF-3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Explorer</td><td>Kintek Corp.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph&amp;nbsp;</td><td>Synergy Software</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

kinetics of lagging-strand dna synthesis in vitro by the bacteriophage t7 replication proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Die Ergebnisse in Figur 1A gezeigt sind, wurden wie in Schritt 1 des Protokolls beschrieben erhalten, dh durch eine manuell Primer - Synthesereaktion durch gp4 unter mehreren Bedingungen Umsatz katalysierten Abtasten. Hier kann eine Reihe von Produkten nach der Gelelektrophorese unter Verwendung von CTP mit 32 P an der α-Position in Primer - Synthesereaktionen (Abbildung 1A) markiert beobachtet werden. Die markierte ...

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Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Kinetik der Verzögerungs-DNA-Synthese<em&gt; In Vitro</em&gt; Von den Bakteriophagen T7 Replikationsproteine

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

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Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Replication

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7.3K Aufrufe.  Harvard Medical School. We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7. 

Serie: Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. The binding of prokaryotic DnaG-like primases to DNA occurs at a specific trinucleotide recognition sequence. It is a pivotal step in the formation of Okazaki fragments. Conventional biochemical tools that are used to determine the DNA recognition sequence of DNA primase provide only limited information. Using a high-throughput microarray-based binding assay and consecutive biochemical analyses, it has been shown that 1) the specific binding context (flanking sequences of the recognition site) influences the binding strength of the DNA primase to its template DNA, and 2) stronger binding of primase to the DNA yields longer RNA primers, indicating higher processivity of the enzyme. This method combines PBM and primase activity assay and is designated as high-throughput primase profiling (HTPP), and it allows characterization of specific sequence recognition by DNA primase in unprecedented time and scalability.&#160;

Protein binding microarray (PBM) experiments combined with biochemical assays link the binding and catalytic properties of DNA primase, an enzyme that synthesizes RNA primers on template DNA. This method, designated as high-throughput primase profiling (HTPP), can be used to reveal DNA-binding patterns of a variety of enzymes.

DNA-Sequenzerkennung durch DNA-Primase mit High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Forschung

Biochemie

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biologie

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA polymerase (RNAP) following a head-on collision is unknown. Here, we find that the E. coli replisome stalls upon collision with a head-on transcription complex, but instead of collapsing, the replication fork remains highly stable and eventually resumes elongation after displacing the RNAP from DNA. We also find that the transcription-repair coupling factor, Mfd, promotes direct restart of the fork following the collision by facilitating displacement of the RNAP. These findings demonstrate the intrinsic stability of the replication apparatus and a novel role for the transcription-coupled repair pathway in promoting replication past a RNAP block.

The fate of the replisome following a collision with a head-on RNA polymerase (RNAP) is unknown. We find that the replisome stalls upon collision with a head-on RNAP, but resumes elongation after displacing the RNAP from DNA. Mfd promotes replication restart by facilitating displacement of the RNAP after the collision.

Direkte Starten eines Replication Fork von einem Head-On RNA Polymerase Stalled

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

Synthese von infektiösen Bakteriophagen in einem E. Coli -basierte zellfreie Expressionssystems

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Biotechnik

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a fluorescence-based approach to quantify DNA, and here, it is adapted to quantify phage genomes as a proxy for phage particles. In this protocol, a facile phage DNA preparation method is described using high-temperature heating without additional DNA purification. The method only needs small volumes of heat-treated phages and small volumes of the qPCR reaction. qPCR is high-throughput and fast, able to process and obtain data from a 96-well plate of reactions in 2&#8211;4 h. Compared to other phage enumeration approaches, qPCR is more time-efficient. Here, qPCR is used to enumerate T7 phages identified from biopanning against in vitro cystic fibrosis-like mucus model. The qPCR method can be extended to quantify T7 phages from other experiments, including other types of biopanning (e.g.,&#160;immobilized protein binding, in vivo phage screening) and other sources (e.g., water systems or body fluids). In summary, this protocol can be modified to quantify any DNA-encapsulated viruses.

A reproducible, accurate, and time efficient quantitative PCR (qPCR) method to enumerate T7 bacteriophage is described here. The protocol clearly describes phage genomic DNA preparation, PCR reaction preparation, qPCR cycling conditions, and qPCR data analysis.

Quantitative PCR von Bakteriophagen T7 aus Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Immunologie und Infektion

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of oligonucleotides in biotechnology and synthetic biology. Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates have historically been prepared in vitro by enzymatic methods. However, these methods are limited to natural RNA oligonucleotides, have strong sequence preferences, and tend to produce heterogeneous products. New methods of chemical triphosphorylation complement both the reduced cost of automated oligonucleotide synthesis by phosphoramidite chemistry and the diverse range of nucleotide modifications now available. Thus, the synthesis of oligonucleotide triphosphates of arbitrary sequence and length, and optionally containing various nonnatural modifications, is now accessible.
This paper presents the appropriate methods and techniques for chemical triphosphorylation of oligonucleotides using salicyl phosphorochloridite and pyrophosphate. This method uses commercially available reagents, is compatible with most oligonucleotides prepared by standard solid-phase synthesis methods, and can be completed in 2 h following oligonucleotide synthesis, before deprotection and purification. Two uses of chemically triphosphorylated oligonucleotides as substrates for catalytic RNA enzymes are demonstrated, including the synthesis of a mirror-image version of the hammerhead ribozyme from nonbiological L-RNA triphosphates.

Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates are ubiquitous components in essential biological pathways and have seen increasing use in biotechnology applications. Here, we describe techniques for the routine synthesis and purification of oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates, starting from oligonucleotides prepared by standard automated synthesis techniques.

Chemische Triphosphorylierung von Oligonukleotiden

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

Erforschung der Dynamik von Phagen-Bakterien im Darm in Mausmodellen unter Verwendung von T4-Phagen

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across all known ecosystems. Within bacterial communities, such as those found in the gut microbiota, phages are implicated in regulating microbiota population dynamics and driving bacterial evolution. There has been renewed interest in phage research in the last decade, in part due to the host-specific killing capabilities of lytic phages, which offer a promising tool to counter the increasing threat of antimicrobial resistant bacteria. Furthermore, recent studies demonstrating that phages adhere to intestinal mucus suggest they may have a protective role in preventing bacterial invasion into the underlying epithelium. Importantly, like bacterial microbiomes, disrupted phageomes have been associated with worsened outcomes in diseases such as inflammatory bowel disease. Previous studies have demonstrated that phages can modulate the microbiome of animals and humans through fecal filtrate transplants, benefiting the host&#39;s health. With this recent wave of research comes the necessity to establish and standardize protocols for studying phages in the context of the gut microbiome. This protocol provides a set of procedures to study isolated T4 phages and their bacterial host, Escherichia coli,&#160;in the context of the murine gastrointestinal tract. The methods described here outline&#160;how to start from a phage lysate, administer it to mice and assess effects on bacterial host and phage levels.&#160;This protocol can be modified and applied to other phage-bacterial pairs and provides a starting point for studying host-phage dynamics in vivo.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung von Bakteriophagen-induzierten Immunantworten bei gnotobiotischen Mäusen

Bacteriophages (phages), viruses that infect bacteria, are an integral component of the gut microbiome. Though these symbiotic inhabitants drive bacterial fitness and population dynamics, little is understood about how they impact gut homeostasis and disease. This protocol studies isolated T4 phages within a mouse model, adaptable to other phage-bacterial pairs.

T4-Bakteriophagen- und E. coli-Interaktion im murinen Darm: Ein prototypisches Modell zur Untersuchung der Wirt-Bakteriophagen-Dynamik in vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

Kinetik der Verzögerungs-DNA-Synthese

Zusammenfassung

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DNA-Sequenzerkennung durch DNA-Primase mit High-Throughput Primase Profiling

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

Direkte Starten eines Replication Fork von einem Head-On RNA Polymerase Stalled

Synthese von infektiösen Bakteriophagen in einem E. Coli -basierte zellfreie Expressionssystems

Quantitative PCR von Bakteriophagen T7 aus Biopanning

Chemische Triphosphorylierung von Oligonukleotiden

T4-Bakteriophagen- und E. coli-Interaktion im murinen Darm: Ein prototypisches Modell zur Untersuchung der Wirt-Bakteriophagen-Dynamik in vivo

T4-Bakteriophagen- und E. coli-Interaktion im murinen Darm: Ein prototypisches Modell zur Untersuchung der Wirt-Bakteriophagen-Dynamik in vivo

T4-Bakteriophagen- und E. coli-Interaktion im murinen Darm: Ein prototypisches Modell zur Untersuchung der Wirt-Bakteriophagen-Dynamik in vivo