We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).

NOT: dahil ancak, eldiven, koruyucu gözlük, laboratuvar önlüğü ve uygun akrilik kalkan olarak, sınırlı kişisel koruyucu ekipman kullanımı değil, radyoaktif malzemenin güvenli kullanımı ve bertarafı ile ilgili tüm kurumsal düzenlemelere uyun. Not: standart tampon 40 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 50 mM potasyum glutamat, 5 mM DTT, 0.1 mM EDTA (Bu tampon 5x konsantrasyonda önceden yapılır) ve her dNTP 0.3 mM oluşur. T7 kopyalama proteinleri, 10 9, 8 tarif edildiği gibi saflaştırılır. Tek bir T7 primaz tanıma sitesi (5&#39;-GGGTC-3 &#39;, 5&#39;-GTGTC-3&#39;, 5&#39;-TGGTC-3 &#39;) ihtiva eden tek şeritli DNA, DNA sentezi, çeşitli şirketler (uzunluğu satın alınabilir ssDNA T7 primaz için, tercih edilen bir enzim bağlı olabilir, bir pentamer tam uzunlukta bir astar sentezlenmesi için en az bir şablon uzunluğu 1Şifreli Cı esas olarak astar polimerazı ile genişletilmesi için ise 1, ancak, ek nükleotidleri şablonunun 3 &#39;ucunda mevcut olması gerekmektedir. Reaksiyonlar, 10 mM MgCl2 nihai bir konsantrasyona ilave edilmesi ile başlatılır ve 25 ° C sıcaklıkta inkübe edilir. Manuel örnekleme 5 saniye veya daha fazla zaman noktaları için iyi çalışır. daha kısa zaman noktası gerekir, doğru veri elde etmek için bir hızlı soğutma akış aleti kullanmak tavsiye edilir. Manuel Örnekleme yoluyla 1. Çoklu-ciro Primer Sentez Reaksiyonu <ol><li> Deneye başlamadan önce, formamid boya tamponu kısım 2 uL (% 93 (h / h) formamid, 50 mM EDTA,% 0.01 iksilen siyanol, mavi,% 0.01 bromofenol) 8 1.5 ml polipropilen tüplere. Genel olarak, tüp sayısı analiz zaman noktalarının sayısına eşittir. </li><li> , 1 x tampon, 0.1 mM ATP ve CTP, 0.25 mCi / ml [32P α-] CTP oluşan bir 20 uL karışım hazırlayın 0.1 uM SSD(Heksamer konsantrasyon olarak ifade - 0.6 mcM monomer) NA şablon ve 0.1 uM GP4. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe karışımı. </li><li> Bir pipet kullanarak karışımı 2 mcL çıkarın ve hiçbir tepki kontrolü (zaman sıfır) için adım 1.1 hazırlanan 1.5 ml tüp içinde 2 mL formamid boya tamponu ile karıştırın. </li><li> (10 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar), reaksiyon karışımına 0.1 M MgCl2 2 uL ekleyin. </li><li> El ile 10 s aralıklarla pipet kullanarak reaksiyon karışımlarının 2 uL örneklerinin alınması ve adım 1.1 hazırlanan 1.5 ml tüpler içinde predispensed formamid boya ile karıştırın. </li><li> ısı bloğu 5 dakika boyunca 95 ° C de bir ısı örnekleri. </li><li> Bir denatüre jel üzerine örneklerin hacimde yükleyin. bisakrilamid T7 primaz tarafından sentezlenen, küçük tetraribonucleotide astar ürünleri 0.4 mm, kalın% 25 akrilamid çözümlenir (19: 1), 3 M üre, 1 x TBE (100 mM Tris-borat, 1mM EDTA). </li><li> Kromatografi üzerinde tüm jel yerleştirinplastik örtü ile phy kağıt ve kapak. Bir jel kurutucu kullanılarak kuru jel. </li><li> Reaksiyon karışımının geri kalan kısmının bir seyreltme serisi hazırlamak ve kromatografi kağıdı üzerine jel üzerine yüklenmiş aynı ses nokta, yani, numunenin 4 uL yüklendiğindekiyle seyreltme 4 ul nokta. NOT: Bu reaksiyon sırasında oluşan ürün konsantrasyonu belirlemek için standart bir eğri olarak hizmet edecektir. Örneğin, TE tamponu (10 mM Tris-HCI, pH 8.0, 1 mM EDTA), bir dizi yayılan iyi iş kullanarak beş kat seyreltme 1:25 ila 1: 15.625 (5 2 -5 6), ama seyreltme olmalıdır aktivitenin seviyesine bağlı olarak ayarlanabilir. </li><li> Bir Phosphorimager ekranını kullanarak kuru jel ve standart Açığa. 12 dilüsyon seri radyoaktivite ölçme ve 8 açıklandığı gibi bir standart eğri oluşturmak Not: Reaksiyon karışımına, T7 DNA polimerazı dahil edilmesi, bir eksa sağlarbenim bu enzim tarafından tetraribonucleotide primerlerin kullanımı. En uygun olarak, polimeraz konsantrasyonu verilerin yorumlanması kolaylaştırmak için doyurarak olmalıdır. 0.4 uM ya da daha yüksek bir polimeraz konsantrasyonu iyi sonuçlar verir. Ek olarak, astar sentezi veya gecikmeli iplikli başlatılması, ya da tek sarmallı DNA bağlayıcı proteinler gibi başka proteinler, etkisi bu şekilde incelenebilir. </li></ol> Bir Rapid-söndürme Enstrüman kullanma 2. Çoklu-ciro Primer Sentez Reaksiyonu <ol><li> Reaksiyon karışımlarının hazırlanması <ol><li> 1x tampon, 0.2 mM ATP ve CTP (CTP [32 P α-] 0.5 mCi / mL olmak üzere 0.2 uM GP4 heksamer, 0.2 uM ssDNA şablonu, 0.6 mM dNTP içeren, çözelti A 400 mcL hazırlayın. </li><li> 1x tamponu ve 20 mM MgCl2 ihtiva eden çözelti, B 400 uL hazırlayın. </li></ol></li><li> Hızlı söndürme akış aracının operasyon <ol><li> rap açınid-söndürme akış enstrüman; Ana menü görünene sonra, cihaz klavyesinde tip 7 ana konumuna şırınga sürücüsü taşımak için. </li><li> &quot;LOAD&quot; Açık tampon şırınga pozisyon. </li></ol></li><li> Yükleme tampon şırıngalar <ol><li> Sürücü şırınga noktasına 10 ml şırınga içeren tampon takın. &quot;LOAD&quot; şırınga topuzu konumunu değiştirin. </li><li> 10 ml şırınga kullanılarak, 10 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA ile gösterge tampon hazne A ve B dolum ve söndürme çözeltisi (250 mM EDTA ve% 0.2 SDS) şırınga C doldurun. ve dışarı pistonları iterek hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> &quot;YANGIN&quot; değiştirin topuzu pozisyonları. Tip 2 şırınga sürücü çubuğunun konumunu ayarlamak için. Basın tampon çıkış döngü çıkana kadar şırınga düşürmek için düğmeye &quot;AŞAĞI AYARLA&quot;: (sürekli aşağı 7-gider; 8-büyük bir adım aşağı, 9-küçük bir adım aşağı). Ana menüye dönmek için &quot;ESC&quot; yazın. </li></ol></li><li> yıkama boru <ol><li> Avvakum ach çıkış hattı. Örnek topuzlar için &quot;FLUSH&quot; olarak değiştirin. yatay konuma düğmeleri ayarlayarak yakın tampon şırınga. Vakum açın ve 10 saniye süreyle H 2 O 2 floş döngüler daldırma, daha sonra 10 saniye boyunca MeOH batırın. ~ 15 sn için hava emerek kuru döngüler, veya kuru kadar. </li></ol></li><li> yükleme örnekleri <ol><li> &quot;LOAD&quot; Change örnek topuzu pozisyonu. 1 ml şırınganın içine çözüm A yerleştirin. Numune yük limanlarından birine şırınga takın. Çözelti B için tekrarlayın ve ters örnek yük limanında yerleştirin. </li></ol></li><li> Zaman noktalarında toplanması <ol><li> Ana menüde, söndürme akış çalıştırmak için 1 yazın. Reaksiyon zamanı (ler) ve Enter tuşuna basın, &quot;ENTER&quot;. Reaksiyon döngü numarası gösterilir kullanmak için. Gerekli reaksiyon döngü geçin. Adım 2.2.4 tekrarlayın yıkama işlemi. </li><li> Örnek topuzlar için &quot;LOAD&quot; çevirin. Yük reaksiyonu sadece merkezi karıştırma bölmesinin dışına kadar örnek döngüler içinde karışır. tüm düğmelerini açmak için &quot;FIRE &quot;. Bütün kolları doğru konumda olduğundan emin olun. </li><li> çıkış döngü ucuna 1.5 mL tüp yerleştirin. Basın reaksiyonu çalıştırmak için &quot;GO&quot;. Adım 2.2.4 tekrarlayın yıkama işlemi. Onlar sürücü vurmak kadar tampon şırıngalar A ve B güncelle. </li><li> İstenen her zaman noktası için adımları yineleyin 2.2.6.2-2.2.6.3. İstisna: Başlangıç reaktifi sıfır zaman noktası kontrolünü söndürülmesi (yani, bu durumda MgCl2) içeren solüsyon yüklemeyin. </li><li> örneklerin toplanması bittiğinde, ana menüye dönmek için &quot;ESC&quot; girin. Basın &quot;7&quot; başlangıç ​​konumuna tampon şırınga sürücüsünü dönün. </li></ol></li><li> Enstrüman temizlik <ol><li> Reaksiyon karışımı şırınga çıkarın. örnek yükleme düğmesini &quot;LOAD&quot; pozisyon çevirin. Vakum altında 10 ml 0.3 NH3 PO 4 ve 10 mL MeOH ve ardından 10 ml 0.2 N NaOH ile her bir örnek döngü yıkayın. </li><li> için &quot;LOAD&quot; pozisyon şırınga topuzlarını çevirin. 3 Syr bastırıninge pistonları reaksiyon ve soğutma tamponlar almak için. Yıkama en az iki kez 5 ml H2O ile şırınga. </li><li> 5 ml H2O ile tekrar şırınga doldurun ve &quot;YANGIN&quot; pozisyon topuzlarını çevirin. Topuzu pozisyon değiştirmek ve adım 2.2.4 deki gibi yıkayın H 2 O. çıkarmak için vakum açın. Cihazı kapatın. Not: adımda 1,7-1,12 tarif edildiği gibi ürünler analiz edildi. Buna ek olarak, T7 DNA polimerazı ve kopyalama proteinleri primer sentezi veya uzantı üzerindeki etkisini analiz etmek için, reaksiyon karışımına ilave edilebilir. </li></ol></li></ol> 3. Tek-ciro Primer Sentez Reaksiyonu NOT: Tek ciro primer sentezi / uzatma deneyleri birkaç büyük farklılıklar, çoklu-ciro reaksiyonlar benzer yürütülmektedir: Bu analizler substratların ancak konsantrasyon, astar veya uzatma ürünleri içine radyoaktif işaretli ATP dönüşüm izleyin ve proteinler considera vardırbly kadar yüksek olur. Buna ek olarak, primer sentezi reaksiyon analizine izin milisaniyelik çözünürlük elde etmek amacıyla, tek bir hızlı-soğutma akış makinesi kullanmak gerekir. <ol><li> Reaksiyon karışımlarının hazırlanması. <ol><li> 1x tamponu, 3 uM GP4 heksamer 6 uM ssDNA şablonu, 0.6 mM dNTP, 1 mM CTP ve 2 nM [P32 γ-] ATP ihtiva eden çözelti, 400 uL hazırlayın. 1x tamponu ve 20 mM MgCl2 ihtiva eden çözelti, B 400 uL hazırlayın. </li></ol></li><li> Hızlı-soğutma akış işlemi <ol><li> Adım 2.2 &#39;de açıklandığı gibi reaksiyonlar yürütmek. Eğer arzu edilirse, sırasıyla 15 uM ve 20 uM arasında bir konsantrasyonda T7 DNA polimeraz ya da T7 tek kollu DNA bağlanma proteini ekleyin. Bu durumda, uzantı ürünleri reaksiyonun elle örnekleme izin veren bir zaman rejimi birikirler. </li></ol></li></ol> 4. Veri Analizi <ol><li> doğrusal olmayan, en hafif sığdır ürün ilerleme eğrilerien küçük kareler yetenekli uyan ve / veya sayısal entegrasyon ticari olarak mevcut yazılım kullanarak kareler modelleri. operasyonun ayrıntıları kullanılan yazılım ile değişir, ancak aşağıda verileri montaj için kullanılan denklemlerin genelleştirilmiş biçimleridir olacaktır. </li><li> lineer bir denklem haline eğrileri ilerlemeye uyan birden fazla devir primer sentezi reaksiyonlarının ürün oluşumunun hızını belirler. Önemli bir kavis ise, tek bir üstel fonksiyon verileri uydurularak başlangıç oranı yöntemi 13, 14 kullanımı: burada: Y (e - k t) = y ürün konsantrasyonu, bir tepkime genlik, k mi gözlenen hız sabiti, t saniye cinsinden zamanı. zaman = 0 teğet çizginin eğimi başlangıçtaki oranıdır. NOT: Bir doğrusal denklem ya da önceden kararlı durum patlama denklemine Fit öncesi kararlı durum primer sentezi reaksiyonları y A (e = - k metTepkime genliği ilk t) + oran ss t, k patlama öncesi kararlı durum patlaması için gözlenen oran sabiti, oran ss kararlı durum oranı ss = k cat [Enzim]) &#39;dir, t zamanı , saniyeler içinde. (- K t e) Tek ciro primer sentezi reaksiyonları tek üstel fonksiyon y = A eğrileri ilerleme takın. GP4 durumunda, ticari olarak temin edilebilen yazılımı kullanılarak, her bir ara enzim ile denge içinde olan, üç NTP kondansasyon adımda, bir model için, sayısal entegrasyonu 15 verileri uygun. </li></ol>

<ol>
	<li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA replication. , (1992).</li><li>Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motors,+switches,+and+contacts+in+the+replisome.">Motors, switches, and contacts in the replisome.</a> Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).</li><li>Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+bacteriophage+T7+gene+4+proteins+in+providing+primase+and+helicase+functions+in+vivo.">Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).</li><li>Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+initiation+and+extension+by+T7+DNA+primase.">Primer initiation and extension by T7 DNA primase.</a> EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).</li><li>Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+architecture+of+the+bacteriophage+T7+primase+couples+RNA+primer+synthesis+to+DNA+synthesis.">Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis.</a> Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).</li><li>Kusakabe, T., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+4+DNA+primase+of+bacteriophage+T7+mediates+the+annealing+and+extension+of+ribo-oligonucleotides+at+primase+recognition+sites.">Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites.</a> J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).</li><li>Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+sequence-specific+template+binding+by+the+DNA+primase+of+bacteriophage+T7.">Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7.</a> Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).</li><li>Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+release+is+the+rate-limiting+event+in+lagging-strand+synthesis+mediated+by+the+T7+replisome.">Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides.">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li><li>Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+bacteriophage+T7+gene+2.5+protein.+A+single-stranded+DNA-binding+protein.">Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein.</a> J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+primases.">DNA primases.</a> Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).</li><li>Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+lysine+residues+in+the+RNA+polymerase+domain+of+the+gene+4+primase-helicase+of+bacteriophage+T7.">Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7.</a> J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).</li><li>Cao, W., De La Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+full+time+course+analysis+of+nonlinear+enzyme+cycling+kinetics.">Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics.</a> Sci Rep. 3, 2658 (2013).</li><li>Wang, M. H., Zhao, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+determining+kinetic+constants+of+complexing+inactivation+at+identical+enzyme+and+inhibitor+concentrations.">A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations.</a> FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer.">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+enzyme+kinetic+analysis,+1913.">A century of enzyme kinetic analysis, 1913.</a> FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).</li><li>Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG.">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).</li><li>Sanyal, G., Doig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+DNA+replication+enzymes+as+targets+for+antibacterial+drug+discovery.">Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu deneyler en önemli faktör son derece aktif saflaştırılmış enzim mevcudiyetidir. GP4 ile çalışma sırasında, örneğin, -20 ° C&#39;de% 50 gliserol ihtiva eden tampon maddesi içinde saflaştırılmış enzim depolama (20 mM potasyum fosfat, pH 7.4, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT) içinde bulunan bir azalmaya yol açar birkaç ay boyunca preparatın spesifik aktivitesi. Bu nedenle, şu anda, saflaştırılmış 25 mM Tris-HCI, pH 7.5, 50 mM NaCI, 0.1 mM EDTA, 1 mM TCEP içinde GP4 ve% 10 gliserol flaş dondurma, k?...

DNA replikasyon bütün hücresel yaşam korunmuş bir özelliğidir. Çoğaltma bileşenlerinin kimlik ve sayısı çok çeşitlilik gösterirken, genel mekanizmalar evrim 1 arasında paylaşılır. Burada, T7 replizom bileşenleri ile in vitro koşullarında geri kalmış iplikli DNA sentezinin kinetik anlamaya yönelik radyoaktif substratlar kullanılarak jel bazlı, sürekli olmayan kinetik deneyler tarif eder. Bakteriyofaj T7 çoğaltma makineleri sadece dört protein (DNA polimeraz, GP5, ve processivity faktörü, E coli tiyoredoksin, iki fonksiyonlu primaz-sarmal GP4, ve tek sarmallı DNA bağlama proteini, GP2 oluşan çok basittir. 5) 2. Bu özellik, DNA replikasyonu katılan korunmuş biyokimyasal mekanizmaları incelemek için çekici bir model sistem yapar. Özel önem, T7 DNA ile ribonükleotid primerlerin oluşumunun yerleştirilir bir Critica primazDNA sentezinin başlamasından l adımı. Buna ek olarak, bir de, reaksiyon karışımına ekleyerek, T7 DNA polimerazı veya başka kopyalama proteinlerine bu primerlerin kullanımı incelenebilir. T7 primaz-helikaz, GP4 primaz tanıma siteleri ya da PRS olarak adlandırılan özel DNA dizileri DNA sentezi için primerlerin oluşmasını (5&#39;-GTC-3 &#39;) katalize eder. PRS sitozin sitenin tanınması için gerekli olan, şifreli, ancak ürünün 3 kopyalanır değildir. GP4 ile astar sentezlenmesinde birinci basamak, daha sonra bir trimer genişletilmiş ve fonksiyonel olarak tetranukleotıd primerlere pppACCC, pppACCA veya pppACAC şablon 4 sekansına bağlı olan dinükleotidin pppAC, oluşturulmasını içerir. Bu primerler daha sonra da GP4 destekli proses 5, 6, DNA sentezini başlatmak için T7 DNA polimerazı ile kullanılabilmektedir. Bu bağlamda, primazetki, çıkmalarını engelleyen, şablonla son derece kısa tetraribonucleotides stabilize polimeraz aktif bölge 7 içine astar / şablon güvence için elverişli bir şekilde DNA polimeraz yürütmektedir. Bu adımlar (RNA primer sentezi, polimeraz primer yayınım ve uzatma) gecikmeli iplikçik çoğaltmak için birden fazla döngüleri tekrarlanır ve lider sarmalı replikasyonu ile koordine edilmelidir. Burada tarif edilen deneyler, son derece hassas olan ve bir orta seviyede bir süre içinde gerçekleştirilebilir. Ancak, nispeten düşük verimlilik ve büyük bir dikkatle radyoaktif maddelerin kullanımı ve bertaraf olunmalıdır. Reaksiyon, bir sabit veya önceden kararlı durumda ya reaksiyon zamanı derslerin anlamlı analiz için mükellef zaman ölçeklerinde örnekleri ulaşmak için hızlı-söndürme cihazı istihdam olabilir hangi hızına bağlı olarak. Son zamanlarda, biz deneyleri Evidenc sağlamak için burada açıklanan kullanılanOkazaki parçaları başlamasında GP4 ve primaz alanından astar salınımının önemi, e. Ayrıca, verimli astar oluşumu ve kullanımı 8. teşvik, protein, gp2.5 bağlayıcı T7 tek iplikli DNA için bir düzenleyici rolünün kanıt bulunamadı.

<table><tbody><tr><td>Tris pre-set crystals&lt;br/&gt; pH 7.5</td><td>SIGMA</td><td>T4128</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>SIGMA</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td><td>SIGMA</td><td>G1501&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>J.T. Baker</td><td>F780-02</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>MP Biomedicals</td><td>811030</td><td></td></tr><tr><td>(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4931-04</td><td></td></tr><tr><td>[&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] CTP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU508H</td><td>radioactive, take protective measures</td></tr><tr><td>[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td>radioactive, take protective measures</td></tr><tr><td>100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&amp;nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>77100</td><td>four dNTPs part of set</td></tr><tr><td>100 mM ATP and CTP</td><td>Epicentre</td><td>RN02825</td><td>part of NTP set</td></tr><tr><td>ssDNA constructs</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>custom sequences&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>methanol&amp;nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3017-08</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>SIGMA</td><td>B8026&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cylene xyanol&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>X4126&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>acrylamide</td><td>SIGMA</td><td>A9099</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Methylenebisacrylamide</td><td>SIGMA</td><td>M7279&amp;nbsp;</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>2549</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Quench-Flow Instrument&amp;nbsp;</td><td>Kintek Corp.</td><td>RQF-3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Explorer</td><td>Kintek Corp.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph&amp;nbsp;</td><td>Synergy Software</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

kinetics of lagging-strand dna synthesis in vitro by the bacteriophage t7 replication proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

El ile birden fazla devir koşulları altında GP4 tarafından katalize edilen bir primer sentezi reaksiyonu örnekleme ile, örneğin, bir protokol aşama 1 &#39;de tarif edildiği gibi, şekil 1A&#39;da gösterilen sonuçlar elde edilmiştir. Burada, jel elektroforezinden sonra bir ürün yelpazesi primer sentezi reaksiyonlarının (Şekil 1A) α-konumunda 32 P ile etiketlenmiş CTP kullanılarak gözlemlenebilir. i...

Watch this Scientific Journal Video about Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins at JoVE.com

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Kaplama DNA sentezinin kinetiği<em&gt; İn Vitro</em&gt; Bakteriyofaj T7 çoğaltma Proteinler tarafından

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

kinetics-lagging-strand-dna-synthesis-vitro-bacteriophage-t7

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Replication

SCIENTISTS IN ACTION

7.3K Görüntüleme.  Harvard Medical School. We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7. 

Video: Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. The binding of prokaryotic DnaG-like primases to DNA occurs at a specific trinucleotide recognition sequence. It is a pivotal step in the formation of Okazaki fragments. Conventional biochemical tools that are used to determine the DNA recognition sequence of DNA primase provide only limited information. Using a high-throughput microarray-based binding assay and consecutive biochemical analyses, it has been shown that 1) the specific binding context (flanking sequences of the recognition site) influences the binding strength of the DNA primase to its template DNA, and 2) stronger binding of primase to the DNA yields longer RNA primers, indicating higher processivity of the enzyme. This method combines PBM and primase activity assay and is designated as high-throughput primase profiling (HTPP), and it allows characterization of specific sequence recognition by DNA primase in unprecedented time and scalability.&#160;

Protein binding microarray (PBM) experiments combined with biochemical assays link the binding and catalytic properties of DNA primase, an enzyme that synthesizes RNA primers on template DNA. This method, designated as high-throughput primase profiling (HTPP), can be used to reveal DNA-binding patterns of a variety of enzymes.

Dna İlkase tarafından DNA Dizisi Tanıma Yüksek-Throughput Primase Profilleme kullanarak

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Biyokimya

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biyoloji

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA polymerase (RNAP) following a head-on collision is unknown. Here, we find that the E. coli replisome stalls upon collision with a head-on transcription complex, but instead of collapsing, the replication fork remains highly stable and eventually resumes elongation after displacing the RNAP from DNA. We also find that the transcription-repair coupling factor, Mfd, promotes direct restart of the fork following the collision by facilitating displacement of the RNAP. These findings demonstrate the intrinsic stability of the replication apparatus and a novel role for the transcription-coupled repair pathway in promoting replication past a RNAP block.

The fate of the replisome following a collision with a head-on RNA polymerase (RNAP) is unknown. We find that the replisome stalls upon collision with a head-on RNAP, but resumes elongation after displacing the RNAP from DNA. Mfd promotes replication restart by facilitating displacement of the RNAP after the collision.

Head-On RNA Polimeraz Stalled Çoğaltma Fork Doğrudan yeniden başlatın

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Biyomühendislik

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a fluorescence-based approach to quantify DNA, and here, it is adapted to quantify phage genomes as a proxy for phage particles. In this protocol, a facile phage DNA preparation method is described using high-temperature heating without additional DNA purification. The method only needs small volumes of heat-treated phages and small volumes of the qPCR reaction. qPCR is high-throughput and fast, able to process and obtain data from a 96-well plate of reactions in 2&#8211;4 h. Compared to other phage enumeration approaches, qPCR is more time-efficient. Here, qPCR is used to enumerate T7 phages identified from biopanning against in vitro cystic fibrosis-like mucus model. The qPCR method can be extended to quantify T7 phages from other experiments, including other types of biopanning (e.g.,&#160;immobilized protein binding, in vivo phage screening) and other sources (e.g., water systems or body fluids). In summary, this protocol can be modified to quantify any DNA-encapsulated viruses.

A reproducible, accurate, and time efficient quantitative PCR (qPCR) method to enumerate T7 bacteriophage is described here. The protocol clearly describes phage genomic DNA preparation, PCR reaction preparation, qPCR cycling conditions, and qPCR data analysis.

T7 bakteriyofaj Biopanning üzerinden kantitatif PCR

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of oligonucleotides in biotechnology and synthetic biology. Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates have historically been prepared in vitro by enzymatic methods. However, these methods are limited to natural RNA oligonucleotides, have strong sequence preferences, and tend to produce heterogeneous products. New methods of chemical triphosphorylation complement both the reduced cost of automated oligonucleotide synthesis by phosphoramidite chemistry and the diverse range of nucleotide modifications now available. Thus, the synthesis of oligonucleotide triphosphates of arbitrary sequence and length, and optionally containing various nonnatural modifications, is now accessible.
This paper presents the appropriate methods and techniques for chemical triphosphorylation of oligonucleotides using salicyl phosphorochloridite and pyrophosphate. This method uses commercially available reagents, is compatible with most oligonucleotides prepared by standard solid-phase synthesis methods, and can be completed in 2 h following oligonucleotide synthesis, before deprotection and purification. Two uses of chemically triphosphorylated oligonucleotides as substrates for catalytic RNA enzymes are demonstrated, including the synthesis of a mirror-image version of the hammerhead ribozyme from nonbiological L-RNA triphosphates.

Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates are ubiquitous components in essential biological pathways and have seen increasing use in biotechnology applications. Here, we describe techniques for the routine synthesis and purification of oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates, starting from oligonucleotides prepared by standard automated synthesis techniques.

Oligonükleotidlerin Kimyasal Trifosforilasyonu

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

T4 Faj Kullanarak Murin Modellerinde Bağırsak Faj-Bakteri Dinamiklerini Keşfetmek

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across all known ecosystems. Within bacterial communities, such as those found in the gut microbiota, phages are implicated in regulating microbiota population dynamics and driving bacterial evolution. There has been renewed interest in phage research in the last decade, in part due to the host-specific killing capabilities of lytic phages, which offer a promising tool to counter the increasing threat of antimicrobial resistant bacteria. Furthermore, recent studies demonstrating that phages adhere to intestinal mucus suggest they may have a protective role in preventing bacterial invasion into the underlying epithelium. Importantly, like bacterial microbiomes, disrupted phageomes have been associated with worsened outcomes in diseases such as inflammatory bowel disease. Previous studies have demonstrated that phages can modulate the microbiome of animals and humans through fecal filtrate transplants, benefiting the host&#39;s health. With this recent wave of research comes the necessity to establish and standardize protocols for studying phages in the context of the gut microbiome. This protocol provides a set of procedures to study isolated T4 phages and their bacterial host, Escherichia coli,&#160;in the context of the murine gastrointestinal tract. The methods described here outline&#160;how to start from a phage lysate, administer it to mice and assess effects on bacterial host and phage levels.&#160;This protocol can be modified and applied to other phage-bacterial pairs and provides a starting point for studying host-phage dynamics in vivo.

Yazar Spotlight: Gnotobiyotik Farelerde Bakteriyofaj Kaynaklı Bağışıklık Tepkilerinin Araştırılması

Bacteriophages (phages), viruses that infect bacteria, are an integral component of the gut microbiome. Though these symbiotic inhabitants drive bacterial fitness and population dynamics, little is understood about how they impact gut homeostasis and disease. This protocol studies isolated T4 phages within a mouse model, adaptable to other phage-bacterial pairs.

Murin Bağırsağında T4 Bakteriyofaj ve E. coli Etkileşimi: İn Vivo Konak-Bakteriyofaj Dinamiğini İncelemek İçin Prototipik Bir Model

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

Kaplama DNA sentezinin kinetiği

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Dna İlkase tarafından DNA Dizisi Tanıma Yüksek-Throughput Primase Profilleme kullanarak

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

Head-On RNA Polimeraz Stalled Çoğaltma Fork Doğrudan yeniden başlatın

Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

T7 bakteriyofaj Biopanning üzerinden kantitatif PCR

Oligonükleotidlerin Kimyasal Trifosforilasyonu

Murin Bağırsağında T4 Bakteriyofaj ve E. coli Etkileşimi: İn Vivo Konak-Bakteriyofaj Dinamiğini İncelemek İçin Prototipik Bir Model

Murin Bağırsağında T4 Bakteriyofaj ve E. coli Etkileşimi: İn Vivo Konak-Bakteriyofaj Dinamiğini İncelemek İçin Prototipik Bir Model

Murin Bağırsağında T4 Bakteriyofaj ve E. coli Etkileşimi: İn Vivo Konak-Bakteriyofaj Dinamiğini İncelemek İçin Prototipik Bir Model