Name: kinetics of lagging-strand dna synthesis in vitro by the bacteriophage t7 replication proteins
Uploaded: 2017-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins at JoVE.com

We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).

NOTA: Seguire tutte le normative istituzionali per quanto riguarda l&#39;uso sicuro e lo smaltimento di materiale radioattivo, incluso ma non limitato a, l&#39;utilizzo di dispositivi di protezione individuale, come guanti, occhiali di sicurezza, camice da laboratorio, e scudi acrilico appropriate. NOTA: Il buffer standard consiste di 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM di potassio glutammato, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA (questo buffer viene pre-fatta ad una concentrazione 5x) e 0,3 mM di ogni dNTP. Proteine replica T7 sono purificati come descritto 8, 9, 10. DNA a singolo filamento contenente un singolo sito di riconoscimento T7 primasi (5&#39;-GGGTC-3 &#39;, 5&#39;-GTGTC-3&#39;, 5&#39;-TGGTC-3 &#39;) possono essere acquistati da una varietà di aziende sintesi del DNA (la lunghezza il ssDNA può dipendere l&#39;enzima di scelta, per T7 primasi, un pentamero è la lunghezza minima template per sintetizzare un primer integrale 11, come il criptico C è essenziale, tuttavia, se il primer deve essere prorogato di polimerasi, nucleotidi aggiuntivo deve essere presente alla fine del 3 &#39;del modello. Le reazioni vengono avviate mediante aggiunta di una concentrazione finale di 10 mM MgCl 2 e incubate a 25 ° C. Campionamento manuale funziona bene per time-punti pari o superiore a 5 secondi. Se sono necessari punti temporali più brevi di questo, si consiglia di utilizzare uno strumento di flusso rapido tempra per ottenere dati precisi. 1. Multiple-fatturato Primer Sintesi Reaction di campionamento manuale <ol><li> Prima di iniziare l&#39;esperimento, un&#39;aliquota 2 ml di tampone dye formamide (93% (v / v) formammide, 50 mM EDTA, 0,01% xilene cianolo e 0,01% blu di bromofenolo) in 8 1.5 mL tubi di polipropilene. In generale, il numero di tubi è uguale al numero di punti temporali analizzati. </li><li> Preparare una miscela costituita da 20 l 1x tampone, 0,1 mM ATP e CTP, 0,25 mCi / mL [α- 32 P] CTP, 0.1 micron SSDmodello di NA, e 0,1 micron GP4 (espressa come concentrazione esamero - 0,6 micron monomero). </li><li> Incubare la miscela a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Rimuovere 2 ml della miscela utilizzando una pipetta e mescolare con 2 ml di buffer colorante formammide in una provetta da 1,5 ml preparata al punto 1.1 per il controllo nessuna reazione (tempo zero). </li><li> Aggiungere 2 ml di 0,1 M MgCl 2 di miscela di reazione (ad una concentrazione finale di 10 mM). </li><li> prelevare manualmente 2 campioni ml di miscele di reazione utilizzando una pipetta ad intervalli di 10 s e mescolare con la tintura formammide dosata in provette da 1,5 ml preparata al punto 1.1. </li><li> campioni di calore a 95 ° C per 5 min in un blocco di calore. </li><li> Caricare aliquote di campioni su un gel denaturante. I piccoli prodotti di primer tetraribonucleotide sintetizzati dal primasi T7 sono risolti bene su un 0,4 mm di spessore 25% acrilammide: bisacrylamide (19: 1), 3 M urea, 1x TBE (100 mM Tris-borato, 1 mM EDTA). </li><li> Mettere tutto il gel sulla crcarta PHY e coprire con pellicola trasparente. gel secco utilizzando un essiccatore gel. </li><li> Preparare una serie di diluizioni del resto della miscela di reazione e macchiare lo stesso volume caricati sul gel cromatografia su carta, cioè, individuare 4 ml della diluizione se 4 ml di campione sono stati caricati. NOTA: Questo servirà come la curva standard per determinare la concentrazione dei prodotti formati durante la reazione. Ad esempio, cinque diluizioni utilizzando tampone TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) funzionano bene, coprono una gamma 1:25 a 1: 15.625 (5 2 -5 6), ma le diluizioni dovrebbero essere regolato a seconda del livello di attività. </li><li> Esporre gel secco e standard utilizzando uno schermo phosphorimager. Quantificare la radioattività nella serie di diluizioni e costruire una curva standard come descritto 8, 12 NOTA: L&#39;inclusione di T7 DNA polimerasi alla miscela di reazione consente di Exala mia l&#39;uso di primer tetraribonucleotide da questo enzima. In modo ottimale, la concentrazione polimerasi va saturando per semplificare l&#39;interpretazione dei dati. Una concentrazione polimerasi di 0,4 micron o superiore dà buoni risultati. Inoltre, l&#39;effetto di altri proteine, come legame al DNA a singolo filamento di proteine, su entrambi sintesi primer o ritardo-strand iniziazione può essere esaminato in questo modo. </li></ol> 2. Multiple-fatturato Primer Sintesi di reazione con uno strumento Rapid-tempra <ol><li> Preparazione di miscele di reazione <ol><li> Preparare 400 ml di soluzione A, contenente tampone 1x, 0,2 micron GP4 esamero, 0,2 um modello ssDNA, 0,6 mm dNTP, 0,2 mM ATP e CTP (compresi 0,5 mCi / ml [α- 32 P] CTP. </li><li> Preparare 400 microlitri di soluzione B, contenente tampone 1x e 20 mm MgCl 2. </li></ol></li><li> Il funzionamento dello strumento flusso rapido tempra <ol><li> Accendere rapstrumento flusso id-tempra; dopo la visualizzazione del menu principale, 7 sulla tastiera dello strumento per spostare la siringa temporizzata alla posizione iniziale. </li><li> posizione siringa aperta buffer &quot;LOAD&quot;. </li></ol></li><li> Siringhe Caricamento tampone <ol><li> Allegare una contenente tampone 10 ml siringa alla porta dell&#39;unità siringa. Cambiare posizione della manopola siringa per &quot;LOAD&quot;. </li><li> Utilizzando 10 siringhe ml, riempire tampone strumento serbatoio A e B con 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA e riempire la siringa C con soluzione di raffreddamento (250 mM EDTA e 0,2% SDS). Rimuovere le bolle d&#39;aria spingendo pistoni dentro e fuori. </li><li> posizioni Modifica manopola su &quot;FIRE&quot;. Tipo 2 per regolare la posizione della barra siringa temporizzata. Premere il tasto &quot;REGOLAZIONE DOWN&quot; per abbassare la siringa fino a tampone viene fuori il loop di uscita: (7-va giù continuamente; 8-grande passo verso il basso; 9-piccole passo verso il basso). Tipo &quot;ESC&quot; per tornare al menu principale. </li></ol></li><li> tubi Wash <ol><li> Attlinea di uscita ach al vuoto. Modificare le manopole di esempio a &quot;filo&quot;. Vicino tampone siringa impostando le manopole in posizione orizzontale. Accendere vuoto e immergere le anse a filo 2 in H 2 O per 10 s, poi immergere in MeOH per 10 s. loop Dry aspirando aria per ~ 15 s, o fino a secco. </li></ol></li><li> Caricamento campioni <ol><li> Cambiare posizione della manopola di esempio per &quot;LOAD&quot;. Mettere la soluzione A alla siringa da 1 ml. Inserire la siringa in una delle porte di carico campione. Ripetere l&#39;operazione per la soluzione B, e posto in fronte al porto di carico del campione. </li></ol></li><li> Raccolta dei termini di punti <ol><li> Nel menu principale, digitare 1 per eseguire tempra-flow. Inserire tempo di reazione (s) e premere il tasto &quot;ENTER&quot;. verranno visualizzati il ​​numero ciclo reazione da usare. Passare a ciclo reazione desiderata. Ripetere procedura di lavaggio nel passaggio 2.2.4. </li><li> Girare le manopole di esempio per &quot;caricare&quot;. reazione del carico mescola in loop del campione fino alle porte del vano di miscelazione centrale. Girare tutte le manopole a &quot;FIRE &quot;. Verificare che tutte le manopole siano nella posizione corretta. </li><li> Mettere 1,5 ml di tubo sulla fine del ciclo di uscita. Premere il tasto &quot;Go&quot; per avviare la reazione. Ripetere procedura di lavaggio nel passaggio 2.2.4. Ricarica siringhe tampone A e B fino a colpire il conducente. </li><li> Ripetere i passaggi 2.2.6.2-2.2.6.3 per ogni punto di tempo desiderato. Eccezione: Non caricare soluzione contenente il reagente di partenza (cioè, MgCl 2 in questo caso) quando tempra il controllo del tempo-zero. </li><li> Al termine la raccolta di campioni, immettere &quot;ESC&quot; per tornare al menu principale. Premere il tasto &quot;7&quot; per tornare conducente tampone siringa alla sua posizione iniziale. </li></ol></li><li> Strumento clean-up <ol><li> Rimuovere reazione siringhe miscela. Ruotare la manopola di carico campione in posizione &quot;LOAD&quot;. Sotto vuoto, lavare ogni ciclo campione con 10 mL di 0,2 N NaOH, seguito da 10 mL 0,3 NH 3 PO 4 e 10 mL di MeOH. </li><li> Girare le manopole siringa in posizione &quot;LOAD&quot;. Premere verso il basso tutti i 3 syrpistoni Inge per recuperare i buffer di reazione e di tempra. Lavare siringhe con 5 mL H 2 O almeno due volte. </li><li> Riempire le siringhe di nuovo con 5 ml di H 2 O e girare le manopole in posizione &quot;FIRE&quot;. Cambiare posizioni della manopola e accendere vuoto per rimuovere H 2 O. filo come al punto 2.2.4. Spegnere strumento. Nota: i prodotti vengono analizzati come descritto nei passaggi 1.7-1.12. Inoltre, polimerasi T7 DNA e altre proteine ​​replica possono essere aggiunti nella miscela di reazione per analizzare il loro effetto sulla sintesi primer o estensione. </li></ol></li></ol> 3. Single-fatturato Primer Sintesi di reazione NOTA: Single-fatturato test di primer sintesi / estensione vengono effettuate in modo simile a reazioni multiple di fatturato, con alcune importanti differenze: questi test seguono la conversione del radiomarcato ATP in primer o di estensione prodotti, tuttavia la concentrazione di substrati e proteine sono consideBly più alto. Inoltre, per raggiungere risoluzione millisecondo per consentire l&#39;analisi della reazione di sintesi di primer, si deve utilizzare una macchina flusso rapido raffreddamento. <ol><li> Preparazione delle miscele di reazione. <ol><li> Preparare 400 ml di soluzione A, contenente tampone 1x, 3 micron esamero GP4, 6 micron modello ssDNA, 0,6 mm dNTP, 1 mM CTP, e 2 nm [γ- 32 P] ATP. Preparare 400 microlitri di soluzione B, contenente tampone 1x e 20 mm MgCl 2. </li></ol></li><li> Il funzionamento del flusso Rapid-tempra <ol><li> Effettuare le reazioni come descritto al punto 2.2. Eventualmente aggiungere polimerasi T7 DNA o proteina legante T7-stranded DNA singola ad una concentrazione di 15 mM e 20 mM, rispettivamente. In questo caso, i prodotti di estensione si accumulano in un regime di tempo che consente il campionamento manuale della reazione. </li></ol></li></ol> Analisi 4. I dati <ol><li> Fit curve di avanzamento dei prodotti a dei minimi non linearemodelli piazze utilizzando il software disponibile in commercio in grado di minimi quadrati adatta e / o integrazione numerica. I dettagli dell&#39;operazione saranno variano a seconda del software utilizzato, ma al di sotto sono forme generalizzate di equazioni utilizzate per il montaggio dei dati. </li><li> Determinare la velocità di formazione del prodotto di molteplici reazioni di sintesi fatturato iniettore inserendo progredire curve ad una equazione lineare. Se c&#39;è una significativa curvatura, utilizzare il metodo tasso iniziale 13, 14 inserendo i dati ad una singola funzione esponenziale: y = A (e - k t), dove y è la concentrazione del prodotto, A è l&#39;ampiezza reazione, k è la costante di velocità osservata, t è il tempo, espresso in secondi. La pendenza della retta tangente al tempo = 0 è il tasso iniziale. NOTA: reazioni di sintesi di primer stato Fit pre-stabili ad una equazione lineare o per l&#39;equazione di stato pre-stazionario scoppiare y = A (e - BU Kprimo t) + tasso ss t, dove A è l&#39;ampiezza di reazione, k scoppio è la costante di velocità osservata per lo scoppio stato pre-stazionario, il tasso ss è lo stato stazionario tasso ss = k gatto [enzima]), t è il tempo , in secondi. Fit reazioni di sintesi di primer singolo fatturato progresso curve ad un singolo esponenziale funzione y = A (e - k t). Nel caso di GP4, inserire i dati per integrazione numerica 15, ad un modello con tre NTP gradini di condensazione, in cui ogni intermedio è in equilibrio con l&#39;enzima, utilizzando un software disponibile in commercio. </li></ol>

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	<li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA replication. , (1992).</li><li>Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motors,+switches,+and+contacts+in+the+replisome.">Motors, switches, and contacts in the replisome.</a> Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).</li><li>Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+bacteriophage+T7+gene+4+proteins+in+providing+primase+and+helicase+functions+in+vivo.">Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).</li><li>Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+initiation+and+extension+by+T7+DNA+primase.">Primer initiation and extension by T7 DNA primase.</a> EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).</li><li>Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+architecture+of+the+bacteriophage+T7+primase+couples+RNA+primer+synthesis+to+DNA+synthesis.">Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis.</a> Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).</li><li>Kusakabe, T., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+4+DNA+primase+of+bacteriophage+T7+mediates+the+annealing+and+extension+of+ribo-oligonucleotides+at+primase+recognition+sites.">Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites.</a> J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).</li><li>Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+sequence-specific+template+binding+by+the+DNA+primase+of+bacteriophage+T7.">Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7.</a> Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).</li><li>Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+release+is+the+rate-limiting+event+in+lagging-strand+synthesis+mediated+by+the+T7+replisome.">Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides.">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li><li>Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+bacteriophage+T7+gene+2.5+protein.+A+single-stranded+DNA-binding+protein.">Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein.</a> J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+primases.">DNA primases.</a> Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).</li><li>Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+lysine+residues+in+the+RNA+polymerase+domain+of+the+gene+4+primase-helicase+of+bacteriophage+T7.">Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7.</a> J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).</li><li>Cao, W., De La Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+full+time+course+analysis+of+nonlinear+enzyme+cycling+kinetics.">Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics.</a> Sci Rep. 3, 2658 (2013).</li><li>Wang, M. H., Zhao, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+determining+kinetic+constants+of+complexing+inactivation+at+identical+enzyme+and+inhibitor+concentrations.">A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations.</a> FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer.">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+enzyme+kinetic+analysis,+1913.">A century of enzyme kinetic analysis, 1913.</a> FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).</li><li>Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG.">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).</li><li>Sanyal, G., Doig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+DNA+replication+enzymes+as+targets+for+antibacterial+drug+discovery.">Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Il fattore più importante nel realizzare questi esperimenti è la disponibilità di enzima purificato altamente attiva. Durante il lavoro con GP4, per esempio, abbiamo scoperto che la memorizzazione dell&#39;enzima purificato in tampone (20 mM fosfato di potassio, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) contenente 50% glicerolo a -20 ° C porta ad una riduzione l&#39;attività specifica del preparato nell&#39;arco di pochi mesi. Pertanto ora flash congelamento piccole aliquote di gp4 purificato in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM ...

La replicazione del DNA è una caratteristica conservato di tutta la vita cellulare. Mentre l&#39;identità e il numero dei componenti di replica variano ampiamente, i meccanismi generali sono condivisi tra evoluzione 1. Qui, descriviamo gel a base, discontinue esperimenti cinetici, utilizzando substrati radioattivi, volti a comprendere la cinetica della sintesi del DNA in ritardo filamento in vitro da componenti del replisoma T7. Il meccanismo di replicazione del batteriofago T7 è molto semplice, composto da soli quattro proteine (la DNA polimerasi, GP5, e il suo fattore processività, E. coli tioredossina, le bifunzionali GP4 primasi-elicasi, e la proteina legante il DNA a singolo filamento, GP2. 5) 2. Questa caratteristica lo rende un sistema interessante modello per studiare i meccanismi conservati biochimici coinvolti nella replicazione del DNA. Particolare enfasi è posta sulla formazione di primer ribonucleotide da T7 DNA primasi, una critical passo per l&#39;inizio della sintesi del DNA. Inoltre, si può anche esaminare l&#39;utilizzo di questi primer di polimerasi T7 DNA o altre proteine ​​di replica includendoli nella miscela di reazione. Il T7 primasi-elicasi, GP4, catalizza la formazione di primer per la sintesi del DNA a specifiche sequenze di DNA chiamati siti di riconoscimento primasi, o PRS, (5&#39;-GTC-3 &#39;). La citosina nel PRS è criptico, è essenziale per il riconoscimento del sito, ma non viene copiato nel prodotto 3. Il primo passo nella sintesi di primer da gp4 comporta la formazione del dinucleotide pppAC, che viene poi estesi ad un trimero, ed eventualmente primers tetranucleotide funzionali pppACCC, pppACCA o pppACAC seconda della sequenza nel modello 4. Questi primer possono essere utilizzati da polimerasi T7 DNA per iniziare la sintesi di DNA, che è anche un processo gp4 assistito 5, 6. A questo proposito, il primasidominio stabilizza i brevissimi tetraribonucleotides con il modello, impedendo loro di dissociazione, si impegna DNA polimerasi in maniera atta a garantire il primer / modello nel polimerasi sito attivo 7. Questi passaggi (RNA sintesi di primer, primer per handoff polimerasi, ed estensione) si ripetono in cicli multipli di replicare il filamento in ritardo e devono essere coordinati con la replicazione del filamento principale. I saggi descritti qui sono altamente sensibili e possono essere eseguite in tempi moderata. Tuttavia, essi sono relativamente bassi-throughput e grande cura deve essere esercitata in uso e lo smaltimento dei materiali radioattivi. A seconda della velocità con cui la reazione procede, si potrebbe impiegare uno strumento rapido raffreddamento per ottenere campioni su scale temporali suscettibili per un&#39;analisi significativa degli insegnamenti tempo di reazione sia stazionario o lo stato pre-stazionario. Recentemente, abbiamo usato saggi descritti qui per fornire evidence dell&#39;importanza del rilascio primer dominio primasi del gp4 nell&#39;avvio di frammenti di Okazaki. Inoltre, abbiamo trovato prove di un ruolo di regolamentazione per il T7 DNA a singolo filamento di proteine, gp2.5 vincolante, nel promuovere la formazione di primer efficiente e l&#39;utilizzo 8.

<table><tbody><tr><td>Tris pre-set crystals&lt;br/&gt; pH 7.5</td><td>SIGMA</td><td>T4128</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>SIGMA</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td><td>SIGMA</td><td>G1501&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>J.T. Baker</td><td>F780-02</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>MP Biomedicals</td><td>811030</td><td></td></tr><tr><td>(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4931-04</td><td></td></tr><tr><td>[&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] CTP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU508H</td><td>radioactive, take protective measures</td></tr><tr><td>[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td>radioactive, take protective measures</td></tr><tr><td>100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&amp;nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>77100</td><td>four dNTPs part of set</td></tr><tr><td>100 mM ATP and CTP</td><td>Epicentre</td><td>RN02825</td><td>part of NTP set</td></tr><tr><td>ssDNA constructs</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>custom sequences&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>methanol&amp;nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3017-08</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>SIGMA</td><td>B8026&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cylene xyanol&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>X4126&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>acrylamide</td><td>SIGMA</td><td>A9099</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Methylenebisacrylamide</td><td>SIGMA</td><td>M7279&amp;nbsp;</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>2549</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Quench-Flow Instrument&amp;nbsp;</td><td>Kintek Corp.</td><td>RQF-3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Explorer</td><td>Kintek Corp.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph&amp;nbsp;</td><td>Synergy Software</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

kinetics of lagging-strand dna synthesis in vitro by the bacteriophage t7 replication proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

I risultati mostrati in figura 1A sono stati ottenuti come descritto al punto 1 del protocollo, cioè, campionando manualmente una reazione di sintesi di primer catalizzata da GP4 in condizioni multiple-turnover. Qui, una gamma di prodotti dopo elettroforesi su gel può essere osservato mediante CTP marcato con 32 P alla α-posizione in reazioni di sintesi di primer (Figura 1A). Il precursore marcato, CTP, mostra la m...

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Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Cinetica di Lagging filamento sintesi del DNA<em&gt; In Vitro</em&gt; Dai replica proteine ​​batteriofago T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

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Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Replication

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7.3K Views.  Harvard Medical School. We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7. 

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DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. The binding of prokaryotic DnaG-like primases to DNA occurs at a specific trinucleotide recognition sequence. It is a pivotal step in the formation of Okazaki fragments. Conventional biochemical tools that are used to determine the DNA recognition sequence of DNA primase provide only limited information. Using a high-throughput microarray-based binding assay and consecutive biochemical analyses, it has been shown that 1) the specific binding context (flanking sequences of the recognition site) influences the binding strength of the DNA primase to its template DNA, and 2) stronger binding of primase to the DNA yields longer RNA primers, indicating higher processivity of the enzyme. This method combines PBM and primase activity assay and is designated as high-throughput primase profiling (HTPP), and it allows characterization of specific sequence recognition by DNA primase in unprecedented time and scalability.&#160;

Protein binding microarray (PBM) experiments combined with biochemical assays link the binding and catalytic properties of DNA primase, an enzyme that synthesizes RNA primers on template DNA. This method, designated as high-throughput primase profiling (HTPP), can be used to reveal DNA-binding patterns of a variety of enzymes.

Riconoscimento della sequenza del DNA da parte del primase del DNA utilizzando la profilazione primasise ad alto valore a più velocità

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Ricerca

Biochimica

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biologia

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA polymerase (RNAP) following a head-on collision is unknown. Here, we find that the E. coli replisome stalls upon collision with a head-on transcription complex, but instead of collapsing, the replication fork remains highly stable and eventually resumes elongation after displacing the RNAP from DNA. We also find that the transcription-repair coupling factor, Mfd, promotes direct restart of the fork following the collision by facilitating displacement of the RNAP. These findings demonstrate the intrinsic stability of the replication apparatus and a novel role for the transcription-coupled repair pathway in promoting replication past a RNAP block.

The fate of the replisome following a collision with a head-on RNA polymerase (RNAP) is unknown. We find that the replisome stalls upon collision with a head-on RNAP, but resumes elongation after displacing the RNAP from DNA. Mfd promotes replication restart by facilitating displacement of the RNAP after the collision.

Riavviare diretta di una forchetta di replica in stallo da un Head-On polimerasi RNA

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

Sintesi dei batteriofagi infettive in un e. coli -basato sistema di espressione senza cellula

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Bioingegneria

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a fluorescence-based approach to quantify DNA, and here, it is adapted to quantify phage genomes as a proxy for phage particles. In this protocol, a facile phage DNA preparation method is described using high-temperature heating without additional DNA purification. The method only needs small volumes of heat-treated phages and small volumes of the qPCR reaction. qPCR is high-throughput and fast, able to process and obtain data from a 96-well plate of reactions in 2&#8211;4 h. Compared to other phage enumeration approaches, qPCR is more time-efficient. Here, qPCR is used to enumerate T7 phages identified from biopanning against in vitro cystic fibrosis-like mucus model. The qPCR method can be extended to quantify T7 phages from other experiments, including other types of biopanning (e.g.,&#160;immobilized protein binding, in vivo phage screening) and other sources (e.g., water systems or body fluids). In summary, this protocol can be modified to quantify any DNA-encapsulated viruses.

A reproducible, accurate, and time efficient quantitative PCR (qPCR) method to enumerate T7 bacteriophage is described here. The protocol clearly describes phage genomic DNA preparation, PCR reaction preparation, qPCR cycling conditions, and qPCR data analysis.

PCR quantitativa del batteriofago T7 da Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Immunologia e infezioni

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of oligonucleotides in biotechnology and synthetic biology. Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates have historically been prepared in vitro by enzymatic methods. However, these methods are limited to natural RNA oligonucleotides, have strong sequence preferences, and tend to produce heterogeneous products. New methods of chemical triphosphorylation complement both the reduced cost of automated oligonucleotide synthesis by phosphoramidite chemistry and the diverse range of nucleotide modifications now available. Thus, the synthesis of oligonucleotide triphosphates of arbitrary sequence and length, and optionally containing various nonnatural modifications, is now accessible.
This paper presents the appropriate methods and techniques for chemical triphosphorylation of oligonucleotides using salicyl phosphorochloridite and pyrophosphate. This method uses commercially available reagents, is compatible with most oligonucleotides prepared by standard solid-phase synthesis methods, and can be completed in 2 h following oligonucleotide synthesis, before deprotection and purification. Two uses of chemically triphosphorylated oligonucleotides as substrates for catalytic RNA enzymes are demonstrated, including the synthesis of a mirror-image version of the hammerhead ribozyme from nonbiological L-RNA triphosphates.

Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates are ubiquitous components in essential biological pathways and have seen increasing use in biotechnology applications. Here, we describe techniques for the routine synthesis and purification of oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates, starting from oligonucleotides prepared by standard automated synthesis techniques.

Trifosforilazione chimica degli oligonucleotidi

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

Esplorazione delle dinamiche dei fagi-batteri intestinali in modelli murini utilizzando il fago T4

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across all known ecosystems. Within bacterial communities, such as those found in the gut microbiota, phages are implicated in regulating microbiota population dynamics and driving bacterial evolution. There has been renewed interest in phage research in the last decade, in part due to the host-specific killing capabilities of lytic phages, which offer a promising tool to counter the increasing threat of antimicrobial resistant bacteria. Furthermore, recent studies demonstrating that phages adhere to intestinal mucus suggest they may have a protective role in preventing bacterial invasion into the underlying epithelium. Importantly, like bacterial microbiomes, disrupted phageomes have been associated with worsened outcomes in diseases such as inflammatory bowel disease. Previous studies have demonstrated that phages can modulate the microbiome of animals and humans through fecal filtrate transplants, benefiting the host&#39;s health. With this recent wave of research comes the necessity to establish and standardize protocols for studying phages in the context of the gut microbiome. This protocol provides a set of procedures to study isolated T4 phages and their bacterial host, Escherichia coli,&#160;in the context of the murine gastrointestinal tract. The methods described here outline&#160;how to start from a phage lysate, administer it to mice and assess effects on bacterial host and phage levels.&#160;This protocol can be modified and applied to other phage-bacterial pairs and provides a starting point for studying host-phage dynamics in vivo.

Autore in primo piano: Studio delle risposte immunitarie indotte da batteriofagi nei topi gnotobiotici

Bacteriophages (phages), viruses that infect bacteria, are an integral component of the gut microbiome. Though these symbiotic inhabitants drive bacterial fitness and population dynamics, little is understood about how they impact gut homeostasis and disease. This protocol studies isolated T4 phages within a mouse model, adaptable to other phage-bacterial pairs.

Interazione tra batteriofago T4 ed E. coli nell'intestino murino: un modello prototipico per lo studio delle dinamiche ospite-batteriofago in vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

Cinetica di Lagging filamento sintesi del DNA

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Riconoscimento della sequenza del DNA da parte del primase del DNA utilizzando la profilazione primasise ad alto valore a più velocità

Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza

Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

Riavviare diretta di una forchetta di replica in stallo da un Head-On polimerasi RNA

Sintesi dei batteriofagi infettive in un e. coli -basato sistema di espressione senza cellula

PCR quantitativa del batteriofago T7 da Biopanning

Trifosforilazione chimica degli oligonucleotidi

Interazione tra batteriofago T4 ed E. coli nell'intestino murino: un modello prototipico per lo studio delle dinamiche ospite-batteriofago in vivo

Interazione tra batteriofago T4 ed E. coli nell'intestino murino: un modello prototipico per lo studio delle dinamiche ospite-batteriofago in vivo

Interazione tra batteriofago T4 ed E. coli nell'intestino murino: un modello prototipico per lo studio delle dinamiche ospite-batteriofago in vivo