We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).

NOTA: Siga todas as normas institucionais relativas à utilização segura e eliminação de material radioactivo, incluindo, mas não limitado a, o uso de equipamento de protecção individual, como luvas, óculos de segurança, jaleco, e escudos de acrílico adequados. NOTA: O tampão padrão consiste em 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, glutamato de potássio 50 mM, DTT 5 mM, EDTA 0,1 mM (tampão esta é pré-fabricados, a uma concentração 5x) e 0,3 mM de cada dNTP. Proteínas de replicação de T7 são purificados como descrito 8, 9, 10. ADN de cadeia simples contendo um único sítio de reconhecimento da primase de T7 (5&#39;-GGGTC-3 &#39;, 5&#39;-GTGTC-3&#39;, 5&#39;-TGGTC-3 &#39;) podem ser adquiridos a partir de uma variedade de companhias de síntese de ADN (o comprimento o ADNcs pode depender da enzima de escolha, para a primase de T7, um pentâmero é o comprimento mínimo do molde para sintetizar um iniciador de comprimento completo 11, como o críptico C é essencial, no entanto, se o iniciador está a ser estendido pela polimerase de, nucleótidos adicionais deve estar presente na extremidade 3 &#39;do molde. As reacções são iniciadas pela adição de uma concentração final de 10 mM de MgCl 2 e incubou-se a 25 ° C. a amostragem manual funciona bem para pontos de tempo de 5 segundos ou mais. Se pontos de tempo mais curto do que são necessárias, é recomendado o uso de um instrumento de fluxo rápido de retardamento para obter dados precisos. 1. Multiple-turnover Primer Síntese Reaction por amostragem manual <ol><li> Antes de iniciar a experiência, alíquota de 2 mL de tampão de corante de formamida (formamida a 93% (v / v) de formamida, 50 mM de EDTA, 0,01% de cianol de xileno e 0,01% de azul de bromofenol) em 8 tubos de polipropileno de 1,5 mL. Em geral, o número de tubos é igual ao número de pontos de tempo analisados. </li><li> Prepara-se uma mistura de 20 uL de tampão 1x que consiste, ATP 0,1 mM e CTP, 0,25 mCi / ml de [32 P α-] CTP, 0,1 uM SSDMolde de NA, e 0,1 uM GP4 (expresso como concentração hexâmero - 0,6 uM monómero). </li><li> Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Retirar 2 ul da mistura utilizando um pipetador e misturar com 2 ul de tampão de formamida de corante num tubo de 1,5 ml, preparado no passo 1.1 para o controlo sem reacção (tempo zero). </li><li> Adicionar 2 mL de 0,1 M MgCl2 a mistura reaccional (para uma concentração final de 10 mM). </li><li> retirar manualmente amostras de 2 mL da misturas reaccionais utilizando um pipetador em intervalos de 10s e misturar-se com corante de formamida predispensed em tubos de 1,5 ml, preparado no passo 1.1. </li><li> amostras de calor a 95 ° C durante 5 min num bloco de calor. </li><li> Carregar alíquotas das amostras num gel desnaturante. Os pequenos produtos de iniciadores tetraribonucleotide sintetizados pelo primase de T7 estão bem resolvidas num 0,4 mm de espessura de 25% de acrilamida: bisacrilamida (19: 1), ureia 3 M, 1 x TBE (Tris-borato de 100, 1 mM de EDTA). </li><li> Coloque toda gel em chromatograpapel phy e cubra com filme plástico. gel seco utilizando um secador de gel. </li><li> Prepara-se uma série de diluições do restante da mistura de reacção e detectar o mesmo volume carregados sobre o gel para papel de cromatografia, ou seja, Spot 4 uL da diluição se 4 ul de amostra foram carregados. NOTA: Este servirá como a curva padrão para determinar a concentração de produtos secundários formados durante a reacção. Por exemplo, diluições de cinco vezes, utilizando tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM) funcionam bem, abrangendo uma gama de 1:25 a 1: 15625 (5 2 -5 6), mas as diluições devem ser ajustado, dependendo do nível de actividade. </li><li> Expor gel seco e padrão usando uma tela phosphorimager. Quantificar a radioactividade na série de diluição e construir uma curva padrão, tal como descrito 8, 12 NOTA: Inclusão de polimerase de ADN de T7 à mistura reaccional permite EXAmina o uso de iniciadores tetraribonucleotide por esta enzima. Optimamente, a concentração da polimerase deve ser saturando para simplificar a interpretação dos dados. A concentração da polimerase de 0,4 uM ou mais elevadas dá bons resultados. Além disso, o efeito de outras proteínas, tais como proteínas de ligação de cadeia simples de ADN, de cada iniciador de síntese ou em atraso de cadeia de iniciação pode ser examinado desta maneira. </li></ol> 2. Multiple-turnover Reaction Primer Síntese Usando um Instrumento Rapid-têmpera <ol><li> Preparação de misturas reaccionais <ol><li> Preparar 400 uL de solução A, contendo tampão 1x, 0,2 uM GP4 hexâmero, 0,2 uM molde de ADNcs, dNTP 0,6 mM, 0,2 mM de ATP e CTP (incluindo 0,5 mCi / ml de [32 P α-] CTP. </li><li> Prepare a 400 ul de solução B, contendo tampão 1x e MgCl2 20 mM. </li></ol></li><li> A operação do instrumento de fluxo rápido-têmpera <ol><li> Ligue rapinstrumento de fluxo id-têmpera; depois de aparecer o menu principal, digite 7 no teclado do instrumento para mover o motorista seringa para a posição inicial. </li><li> posição seringa aberta tampão para &quot;LOAD&quot;. </li></ol></li><li> Seringas Carregando tampão <ol><li> Anexar um tampão contendo 10 mL seringa à porta seringa unidade. Alterar posição do botão de seringa para &quot;LOAD&quot;. </li><li> Usando 10 mL seringas, encher tampão instrumento reservatório A e B com 10 mM de Tris, pH 7,5, EDTA 1 mM e encher a seringa C com solução de paragem (EDTA 250 mM, e SDS a 0,2%). Remover bolhas de ar empurrando êmbolos dentro e para fora. </li><li> posições Alterar botão para &quot;FOGO&quot;. Digite 2 para ajustar a posição da barra de motorista seringa. Pressione o botão &quot;AJUSTE PARA BAIXO&quot; botão para baixar a seringa até tampão sai do loop de saída: (7-desce continuamente; 8 grande passo para baixo; 9-pequeno passo para baixo). Tipo &quot;ESC&quot; para voltar ao menu principal. </li></ol></li><li> tubos de lavagem <ol><li> Attach linha de saída para vácuo. Alterar botões de amostra para &quot;FLUSH&quot;. Fechar tampão de seringa definindo as pegas para a posição horizontal. Ligue vácuo e mergulhar as alças 2 de descarga em H2O durante 10 s, em seguida, mergulhar em MeOH durante 10 s. lacetes secas por sugar o ar para ~ 15 s, ou até secar. </li></ol></li><li> de colocar as amostras <ol><li> Mudança amostra posição do botão de &quot;Load&quot;. Coloque a solução A à seringa de 1 mL. Ligue seringa em uma das portas de carga da amostra. Repita o procedimento para a solução B, e coloque no porto de carga amostra oposto. </li></ol></li><li> Recolha de pontos temporais <ol><li> No menu principal, digite 1 para execução de têmpera-flow. Digite o tempo de reação (s) e pressione &quot;ENTER&quot;. O número de loop reação a utilizar será exibida. Mudar para loop de reacção necessário. Repita o procedimento de lavagem no passo 2.2.4. </li><li> Vire botões de amostra para &quot;carregar&quot;. reação carga mistura em loops até pouco fora do compartimento de mistura central. Coloque todos os botões para &quot;FIRE &quot;. Confirmar que todos os botões estão na posição correcta. </li><li> Coloque 1,5 mL tubo na extremidade do circuito de saída. Pressione o botão &quot;GO&quot; para executar a reação. Repita o procedimento de lavagem no passo 2.2.4. Recarregar seringas tampão A e B, até que atingiu o motorista. </li><li> Repetir passos 2.2.6.2-2.2.6.3 para cada ponto de tempo desejado. Exceção: Não coloque solução contendo o reagente de partida (ou seja, MgCl 2, neste caso) quando apagar o controle de tempo de ponto-zero. </li><li> Quando terminar a recolha de amostras, digite &quot;ESC&quot; para voltar ao menu principal. Pressione o botão &quot;7&quot; para voltar motorista tampão seringa para sua posição inicial. </li></ol></li><li> Instrumento de limpeza <ol><li> Remover seringas mistura de reacção. Vire amostra de carga botão para &quot;LOAD&quot; posição. Sob vácuo, lavar cada circuito de amostra com 10 mL de NaOH 0,2 N, seguido de 10 ml de 0,3 NH 3 PO 4 e 10 mL de MeOH. </li><li> Vire botões de seringa para a posição &quot;LOAD&quot;. Pressione os 3 syringe êmbolos para recuperar de reacção e extingue-se tampões. Lavar seringas com 5 mL de H 2 O, pelo menos, duas vezes. </li><li> Preencha seringas novamente com 5 mL de H2O e vire botões para &quot;fogo&quot; posição. Mudar posições dos botões e ligue vácuo para remover H 2 O. Lavar como no passo 2.2.4. Desligue instrumento. Nota: Os produtos são analisados conforme descrito nas etapas 1.7-1.12. Além disso, a polimerase de ADN de T7 e outras proteínas de replicação pode ser adicionado na mistura de reacção para analisar o seu efeito sobre a síntese de iniciador ou de extensão. </li></ol></li></ol> 3.-turnover Individual Primer Síntese Reaction NOTA: Os ensaios de iniciador de síntese / extensão-turnover único são levadas a cabo de modo semelhante às reacções de múltiplas volume de negócios, com algumas diferenças importantes: estes ensaios segue a conversão de ATP marcado radioactivamente no iniciador ou de extensão de produtos, no entanto, a concentração de substratos e proteínas são considerăBly superior. Além disso, a fim de atingir a resolução de milisegundos para permitir a análise da reacção de síntese de iniciadores, deve-se utilizar uma máquina de fluxo rápido-têmpera. <ol><li> Preparação das misturas de reacção. <ol><li> Preparar 400 uL de solução A, contendo tampão 1x, 3 uM hexâmero GP4, 6 uM molde de ADNcs, dNTPs 0,6 mM, CTP a 1 mM, e 2 nM de [γ- 32 P] ATP. Prepare a 400 ul de solução B, contendo tampão 1x e MgCl2 20 mM. </li></ol></li><li> Operação de fluxo Rapid-têmpera <ol><li> Realizar reacções tal como descrito na etapa 2.2. Se desejado, adicionar ADN-polimerase T7 ou a proteína de ligação-ADN de cadeia simples de T7 a uma concentração de 15 uM e 20 uM, respectivamente. Neste caso, os produtos de extensão acumulam num regime de tempo que permite a amostragem manual da reacção. </li></ol></li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> curvas de progresso do produto Fit para menos- não-linearquadrados modelos usando software disponível comercialmente capazes de mínimos quadrados ajustes e / ou integração numérica. Os detalhes da operação irá variar de acordo com o software utilizado, mas abaixo são formas generalizadas de equações utilizadas para ajustamento dos dados. </li><li> Determinar a velocidade de formação de produto de múltiplas reacções de síntese de rotatividade iniciador ajustando a curva de progresso de uma equação linear. Se houver curvatura significativa, utilizar o método da taxa inicial 13, 14, através do ajuste dos dados a uma função exponencial simples: y = A (e - k t), onde y é a concentração de produto, A é a amplitude de reacção, k é a constante de velocidade observada, t é o tempo, em segundos. A inclinação da linha tangente em tempo = 0 é a velocidade inicial. NOTA: reações de síntese de primer estado Fit pré-constante para uma equação linear ou para a equação de estado pré-estacionário estouro y = A (e - bu krst t) + taxa ss t, em que A é a amplitude da reacção, k ruptura é a constante de velocidade observada para a explosão estado pré-estável, SS taxa é o estado estacionário ss Velocidade = k cat [Enzima]), t é o tempo , em segundos. Fit reações de síntese primer volume de negócios única curva de progresso para uma única função exponencial y = A (e - k t). No caso de GP4, ajustar os dados por integração numérica 15, para um modelo com três passos de condensação de NTP, em que cada intermédia está em equilíbrio com a enzima, utilizando software disponível comercialmente. </li></ol>

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	<li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA replication. , (1992).</li><li>Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motors,+switches,+and+contacts+in+the+replisome.">Motors, switches, and contacts in the replisome.</a> Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).</li><li>Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+bacteriophage+T7+gene+4+proteins+in+providing+primase+and+helicase+functions+in+vivo.">Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).</li><li>Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+initiation+and+extension+by+T7+DNA+primase.">Primer initiation and extension by T7 DNA primase.</a> EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).</li><li>Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+architecture+of+the+bacteriophage+T7+primase+couples+RNA+primer+synthesis+to+DNA+synthesis.">Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis.</a> Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).</li><li>Kusakabe, T., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+4+DNA+primase+of+bacteriophage+T7+mediates+the+annealing+and+extension+of+ribo-oligonucleotides+at+primase+recognition+sites.">Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites.</a> J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).</li><li>Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+sequence-specific+template+binding+by+the+DNA+primase+of+bacteriophage+T7.">Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7.</a> Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).</li><li>Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+release+is+the+rate-limiting+event+in+lagging-strand+synthesis+mediated+by+the+T7+replisome.">Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides.">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li><li>Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+bacteriophage+T7+gene+2.5+protein.+A+single-stranded+DNA-binding+protein.">Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein.</a> J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+primases.">DNA primases.</a> Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).</li><li>Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+lysine+residues+in+the+RNA+polymerase+domain+of+the+gene+4+primase-helicase+of+bacteriophage+T7.">Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7.</a> J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).</li><li>Cao, W., De La Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+full+time+course+analysis+of+nonlinear+enzyme+cycling+kinetics.">Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics.</a> Sci Rep. 3, 2658 (2013).</li><li>Wang, M. H., Zhao, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+determining+kinetic+constants+of+complexing+inactivation+at+identical+enzyme+and+inhibitor+concentrations.">A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations.</a> FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer.">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+enzyme+kinetic+analysis,+1913.">A century of enzyme kinetic analysis, 1913.</a> FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).</li><li>Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG.">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).</li><li>Sanyal, G., Doig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+DNA+replication+enzymes+as+targets+for+antibacterial+drug+discovery.">Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

O factor mais importante na realização destas experiências é a disponibilidade da enzima purificada altamente activa. Durante o nosso trabalho com GP4, por exemplo, verificou-se que o armazenamento da enzima purificada em tampão (fosfato de potássio 20 mM, pH 7,4, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM) contendo 50% de glicerol a -20 ° C, leva a uma redução a actividade específica da preparação ao longo de alguns meses. Portanto, agora flash-freeze pequenas alíquotas de GP4 purificada em Tris-HCl a 25, pH 7,5, NaCl 50 mM, E...

A replicação de ADN é uma característica conservada de toda a vida celular. Enquanto a identidade e número de componentes de replicação variam amplamente, os mecanismos gerais são compartilhadas entre a evolução 1. Aqui, descrevemos, experimentos cinéticos descontínuos à base de gel, utilizando substratos radioativos, visando a compreensão da cinética de síntese de DNA atraso vertente in vitro por componentes do replisome T7. A maquinaria de replicação do bacteriófago T7 é muito simples, consistindo em apenas quatro proteínas (a polimerase de ADN, GP5, e o seu factor de processabilidade, tioredoxina de E. coli, os GP4 primase-helicase bifuncionais, e a proteína de ligação ao ADN de cadeia simples, GP2. 5) 2. Esta característica torna-se um sistema de modelo atractivo para estudar os mecanismos bioquímicos conservadas envolvidas na replicação do ADN. Especial ênfase é colocada sobre a formação de primers ribonucleï¿½ido por DNA T7 primase, uma critical passo na iniciação de síntese de ADN. Além disso, pode-se também analisar a utilização desses iniciadores por ADN-polimerase de T7 ou outras proteínas de replicação através da sua inclusão na mistura de reacção. A primase de T7-helicase, GP4, catalisa a formação de iniciadores para a síntese de DNA em sequências de ADN específicos chamados locais de reconhecimento, ou primase PRS, (5&#39;-TCG-3 &#39;). A citosina no PRS é enigmática, é essencial para o reconhecimento do local, mas não é copiado para o produto 3. O primeiro passo na síntese do iniciador por GP4 envolve a formação do dinucleótido pppAC, que é então estendida a um trímero, e, eventualmente, a iniciadores tetranucleotídeo funcionais pppACCC, pppACCA, ou pppACAC dependendo da sequência no molde 4. Estes iniciadores podem então ser utilizados por ADN-polimerase de T7 para iniciar a síntese de ADN, que é também um processo assistido por GP4 5, 6. A este respeito, o primasedomínio estabiliza os tetraribonucleotides extremamente curtos com o modelo, impedindo a sua dissociação, envolve polimerase ADN de uma forma conducente a garantir o primer / modelo no sítio ativo 7 polimerase. Estes passos (a síntese de ARN do iniciador, a polimerase de handoff iniciador, e extensão) são repetidos em ciclos múltiplos de replicar a costa de retardamento e tem de ser coordenado com a replicação da costa principal. Os ensaios descritos aqui são altamente sensíveis e podem ser executadas num período de tempo moderado. No entanto, eles são relativamente de baixo rendimento e um grande cuidado deve ser exercido no uso e descarte de materiais radioativos. Dependendo da velocidade à qual a reacção prossegue, pode-se empregar um instrumento de têmpera rápida para atingir as amostras em escalas de tempo favorável para análise significativa de cursos de tempo da reacção, quer em contínuo ou no estado pré-estável. Recentemente, usamos ensaios descritos aqui para fornecer evidence a importância da introdução do iniciador a partir do domínio de primase de GP4 na iniciação de fragmentos de Okazaki. Além disso, encontramos evidências de um papel regulador para a proteína, gp2.5 ligação do T7 DNA de cadeia simples, na promoção da formação de primer eficiente e utilização 8.

<table><tbody><tr><td>Tris pre-set crystals&lt;br/&gt; pH 7.5</td><td>SIGMA</td><td>T4128</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>SIGMA</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td><td>SIGMA</td><td>G1501&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>J.T. Baker</td><td>F780-02</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>MP Biomedicals</td><td>811030</td><td></td></tr><tr><td>(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4931-04</td><td></td></tr><tr><td>[&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] CTP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU508H</td><td>radioactive, take protective measures</td></tr><tr><td>[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td>radioactive, take protective measures</td></tr><tr><td>100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&amp;nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>77100</td><td>four dNTPs part of set</td></tr><tr><td>100 mM ATP and CTP</td><td>Epicentre</td><td>RN02825</td><td>part of NTP set</td></tr><tr><td>ssDNA constructs</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>custom sequences&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>methanol&amp;nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3017-08</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>SIGMA</td><td>B8026&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cylene xyanol&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>X4126&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>acrylamide</td><td>SIGMA</td><td>A9099</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Methylenebisacrylamide</td><td>SIGMA</td><td>M7279&amp;nbsp;</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>2549</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Quench-Flow Instrument&amp;nbsp;</td><td>Kintek Corp.</td><td>RQF-3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Explorer</td><td>Kintek Corp.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph&amp;nbsp;</td><td>Synergy Software</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

kinetics of lagging-strand dna synthesis in vitro by the bacteriophage t7 replication proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Os resultados mostrados na Figura 1A foram obtidos como descrito no passo 1 do protocolo, isto é, por amostragem manualmente uma reacção de síntese de primer catalisada por GP4 sob condições de turnover múltiplo. Aqui, uma gama de produtos, após electroforese em gel pode ser observado usando CTP marcado com 32 P na posição-α em reacções de síntese do iniciador (Figura 1A). O precursor marcado, CTP, mostr...

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Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Cinética da Síntese da Fita Atrasada de DNA  In Vitro pelas Proteínas de Replicação do Bacteriófago T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

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Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Replication

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7.3K visualizações.  Harvard Medical School. We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7. 

Vídeo: Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. The binding of prokaryotic DnaG-like primases to DNA occurs at a specific trinucleotide recognition sequence. It is a pivotal step in the formation of Okazaki fragments. Conventional biochemical tools that are used to determine the DNA recognition sequence of DNA primase provide only limited information. Using a high-throughput microarray-based binding assay and consecutive biochemical analyses, it has been shown that 1) the specific binding context (flanking sequences of the recognition site) influences the binding strength of the DNA primase to its template DNA, and 2) stronger binding of primase to the DNA yields longer RNA primers, indicating higher processivity of the enzyme. This method combines PBM and primase activity assay and is designated as high-throughput primase profiling (HTPP), and it allows characterization of specific sequence recognition by DNA primase in unprecedented time and scalability.&#160;

Protein binding microarray (PBM) experiments combined with biochemical assays link the binding and catalytic properties of DNA primase, an enzyme that synthesizes RNA primers on template DNA. This method, designated as high-throughput primase profiling (HTPP), can be used to reveal DNA-binding patterns of a variety of enzymes.

Reconhecimento da seqüência do ADN pelo primase do ADN usando o perfilamento da primase da elevado-produção

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Bioquímica

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biologia

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA polymerase (RNAP) following a head-on collision is unknown. Here, we find that the E. coli replisome stalls upon collision with a head-on transcription complex, but instead of collapsing, the replication fork remains highly stable and eventually resumes elongation after displacing the RNAP from DNA. We also find that the transcription-repair coupling factor, Mfd, promotes direct restart of the fork following the collision by facilitating displacement of the RNAP. These findings demonstrate the intrinsic stability of the replication apparatus and a novel role for the transcription-coupled repair pathway in promoting replication past a RNAP block.

The fate of the replisome following a collision with a head-on RNA polymerase (RNAP) is unknown. We find that the replisome stalls upon collision with a head-on RNAP, but resumes elongation after displacing the RNAP from DNA. Mfd promotes replication restart by facilitating displacement of the RNAP after the collision.

Reinicie direta de um garfo de replicação travado por uma RNA polimerase Head-On

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

Síntese de bacteriófagos infecciosa em uma e. coli-com base em sistema de expressão livre de célula

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Bioengenharia

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a fluorescence-based approach to quantify DNA, and here, it is adapted to quantify phage genomes as a proxy for phage particles. In this protocol, a facile phage DNA preparation method is described using high-temperature heating without additional DNA purification. The method only needs small volumes of heat-treated phages and small volumes of the qPCR reaction. qPCR is high-throughput and fast, able to process and obtain data from a 96-well plate of reactions in 2&#8211;4 h. Compared to other phage enumeration approaches, qPCR is more time-efficient. Here, qPCR is used to enumerate T7 phages identified from biopanning against in vitro cystic fibrosis-like mucus model. The qPCR method can be extended to quantify T7 phages from other experiments, including other types of biopanning (e.g.,&#160;immobilized protein binding, in vivo phage screening) and other sources (e.g., water systems or body fluids). In summary, this protocol can be modified to quantify any DNA-encapsulated viruses.

A reproducible, accurate, and time efficient quantitative PCR (qPCR) method to enumerate T7 bacteriophage is described here. The protocol clearly describes phage genomic DNA preparation, PCR reaction preparation, qPCR cycling conditions, and qPCR data analysis.

PCR quantitativo do bacteriófago T7 de Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Imunologia e Infecção

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of oligonucleotides in biotechnology and synthetic biology. Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates have historically been prepared in vitro by enzymatic methods. However, these methods are limited to natural RNA oligonucleotides, have strong sequence preferences, and tend to produce heterogeneous products. New methods of chemical triphosphorylation complement both the reduced cost of automated oligonucleotide synthesis by phosphoramidite chemistry and the diverse range of nucleotide modifications now available. Thus, the synthesis of oligonucleotide triphosphates of arbitrary sequence and length, and optionally containing various nonnatural modifications, is now accessible.
This paper presents the appropriate methods and techniques for chemical triphosphorylation of oligonucleotides using salicyl phosphorochloridite and pyrophosphate. This method uses commercially available reagents, is compatible with most oligonucleotides prepared by standard solid-phase synthesis methods, and can be completed in 2 h following oligonucleotide synthesis, before deprotection and purification. Two uses of chemically triphosphorylated oligonucleotides as substrates for catalytic RNA enzymes are demonstrated, including the synthesis of a mirror-image version of the hammerhead ribozyme from nonbiological L-RNA triphosphates.

Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates are ubiquitous components in essential biological pathways and have seen increasing use in biotechnology applications. Here, we describe techniques for the routine synthesis and purification of oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates, starting from oligonucleotides prepared by standard automated synthesis techniques.

Triphosforilação química de Oligonucleotídeos

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

Explorando a dinâmica da fago-bactéria intestinal em modelos murinos usando o fago T4

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across all known ecosystems. Within bacterial communities, such as those found in the gut microbiota, phages are implicated in regulating microbiota population dynamics and driving bacterial evolution. There has been renewed interest in phage research in the last decade, in part due to the host-specific killing capabilities of lytic phages, which offer a promising tool to counter the increasing threat of antimicrobial resistant bacteria. Furthermore, recent studies demonstrating that phages adhere to intestinal mucus suggest they may have a protective role in preventing bacterial invasion into the underlying epithelium. Importantly, like bacterial microbiomes, disrupted phageomes have been associated with worsened outcomes in diseases such as inflammatory bowel disease. Previous studies have demonstrated that phages can modulate the microbiome of animals and humans through fecal filtrate transplants, benefiting the host&#39;s health. With this recent wave of research comes the necessity to establish and standardize protocols for studying phages in the context of the gut microbiome. This protocol provides a set of procedures to study isolated T4 phages and their bacterial host, Escherichia coli,&#160;in the context of the murine gastrointestinal tract. The methods described here outline&#160;how to start from a phage lysate, administer it to mice and assess effects on bacterial host and phage levels.&#160;This protocol can be modified and applied to other phage-bacterial pairs and provides a starting point for studying host-phage dynamics in vivo.

Autor em destaque: Investigando respostas imunes induzidas por bacteriófagos em camundongos gnotobióticos

Bacteriophages (phages), viruses that infect bacteria, are an integral component of the gut microbiome. Though these symbiotic inhabitants drive bacterial fitness and population dynamics, little is understood about how they impact gut homeostasis and disease. This protocol studies isolated T4 phages within a mouse model, adaptable to other phage-bacterial pairs.

Interação Bacteriófago T4 e E. coli no Intestino Murino: Um Modelo Prototípico para Estudo da Dinâmica Hospedeiro-Bacteriófago In Vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

Cinética da Síntese da Fita Atrasada de DNA In Vitro pelas Proteínas de Replicação do Bacteriófago T7

Resumo

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Reconhecimento da seqüência do ADN pelo primase do ADN usando o perfilamento da primase da elevado-produção

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

Reinicie direta de um garfo de replicação travado por uma RNA polimerase Head-On

Síntese de bacteriófagos infecciosa em uma e. coli-com base em sistema de expressão livre de célula

PCR quantitativo do bacteriófago T7 de Biopanning

Triphosforilação química de Oligonucleotídeos

Interação Bacteriófago T4 e E. coli no Intestino Murino: Um Modelo Prototípico para Estudo da Dinâmica Hospedeiro-Bacteriófago In Vivo

Interação Bacteriófago T4 e E. coli no Intestino Murino: Um Modelo Prototípico para Estudo da Dinâmica Hospedeiro-Bacteriófago In Vivo

Interação Bacteriófago T4 e E. coli no Intestino Murino: Um Modelo Prototípico para Estudo da Dinâmica Hospedeiro-Bacteriófago In Vivo