Name: kinetics of lagging-strand dna synthesis in vitro by the bacteriophage t7 replication proteins
Uploaded: 2017-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins at JoVE.com

We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).

הערה: מלאו אחר כל התקנות המוסדיות לגבי השימוש הבטוח והסילוק של חומר רדיואקטיבי, לרבות אך לא רק, שימוש בציוד מגן אישי, כגון כפפות, משקפי מגן, חלוק מעבדה, ומגינים אקריליק מתאימים. הערה: המאגר סטנדרטי מורכב מ -40 מ&quot;מ HEPES-KOH, pH 7.5, 50 גלוטמט אשלגן מ&quot;מ, 5 מ&quot;מ DTT, 0.1 mM EDTA (חיץ זה שהוכן מראש בריכוז 5x) ו -0.3 מ&quot;מ של כל dNTP. חלבונים שכפול T7 הם מטוהרים כמתואר 8, 9, 10. דנ&quot;א חד-גדילי המכיל אתר הכרה primase יחיד T7 (5&#39;-GGGTC-3 &quot;, 5&#39;-GTGTC-3&quot;, 5&#39;-TGGTC-3 &#39;) ניתן לרכוש ממגוון רחב של חברות סינתזה DNA (אורך של ssDNA יכול להיות תלוי האנזים של בחירה עבור primase T7, pentamer הוא אורך תבנית המינימום לסנתז פריימר באורך מלא 11, כמו C הנסתר חיוני, אולם אם היה פריימר הוא תוארך פולימראז, נוקלאוטידים נוסף חייב להיות נוכח בסוף &#39;3 של התבנית. תגובות יזומים על ידי תוספת של ריכוז סופי של 10 מ&quot;מ MgCl 2 וטופחו על 25 מעלות צלזיוס. דגימה ידנית עובדת היטב עבור נקודות זמן של 5 שניות או יותר. אם בזמן נקודות קצרות מזו נדרשות, מומלץ להשתמש באמצעי זרימה מהיר-להרוות להשיג נתונים מדויקים. 1. תגובת סינתזת פריימר מרובה-מחזור ידי דגימה ידנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת הניסוי, aliquot 2 μL של חיץ לצבוע לפוראמיד (93% (V / V לפוראמיד), 50 מ&quot;מ EDTA, 0.01% cyanol קסילן ו 0.01% bromophenol כחול) לתוך 8 1.5 צינורות פוליפרופילן מ&quot;ל. באופן כללי, מספר צינורות שווה למספר נקודות זמן המנותח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת 20 μL המורכב חיץ 1x, 0.1 מ&quot;מ ATP ו CTP, 0.25 MCI / מ&quot;ל [α- 32 P] CTP, 0.1 מיקרומטר SSDתבנית NA, ו -0.1 מיקרומטר gp4 (מבוטא ריכוז hexamer - 0.6 מיקרומטר מונומר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 2 μL של התערובת באמצעות pipettor ומערבבים עם 2 μL חיץ לצבוע לפוראמיד צינור 1.5 מ&quot;ל מוכן בשלב 1.1 עבור כל שליטה התגובה (זמן אפס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μL של 0.1 M MgCl 2 לתערובת התגובה (לריכוז סופי של 10 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני למשוך 2 דגימות μL של תערובות התגובה באמצעות pipettor ב 10 מרווחי ים ומערבבים עם צבע לפוראמיד predispensed ב 1.5 צינורות מ&quot;ל מוכן בשלב 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מחממים על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בתוך גוש חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען aliquots של דגימות על ג&#39;ל denaturing. המוצרים פריימר tetraribonucleotide קטן מסונתז על ידי primase T7 נפתרות היטב על acrylamide 0.4 מ&quot;מ עובי 25%: bisacrylamide (19: 1), 3 M אוריאה, TBE 1x (100 מ&quot;מ טריס-borate, 1 mM EDTA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ג&#39;ל כולו על chromatograPHY נייר ומכסים בניילון נצמד. ג&#39;ל ניקוי באמצעות היבשים ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן סדרת דילול של שארית תערובת התגובה ספוט באותו הנפח טעון על הג&#39;ל על גבי נייר כרומטוגרפיה, כלומר, במקום 4 μL של הדילול אם 4 μL של מדגם הועמס. הערה: זה ישמש את עקומת התקן כדי לקבוע את הריכוז של מוצרים נוצרו במהלך התגובה. לדוגמה, פי חמישה דילולים באמצעות TE חיץ (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) עובד טוב, פורש מגוון של 1:25 עד 1: 15.625 (5 2 -5 6), אבל דילולים צריך להיות מותאם בהתאם לרמת הפעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף ג&#39;ל יבש רגיל באמצעות מסך phosphorimager. לכמת את הרדיואקטיביות בסדרת הדילול לבנות עקום סטנדרט כמתואר 8, 12 הערה: הכללה של DNA פולימראז T7 לתערובת התגובה מאפשרת לאדם EXAשלי השימוש של פריימרים tetraribonucleotide ע&quot;י אנזים זה. באופן אופטימלי, ריכוז פולימראז יש להרוות כדי לפשט את הפרשנות של הנתונים. ריכוז פולימראז של 0.4 מיקרומטר ומעלה נותן תוצאות טובות. בנוסף, ההשפעה של חלבונים אחרים, כגון חלבונים מחייב חד גדילי דנ&quot;א, משני סינתזה פריימר או חניכה גדיל מפגרת ניתן לבדוק בדרך זו. </li></ol> 2. תגובת סינתזת פריימר מרובה-מחזור באמצעות מכשיר Rapid-להרוות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תערובות התגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 400 μL של פתרון, המכיל חיץ 1x, 0.2 מיקרומטר hexamer gp4, 0.2 תבנית ssDNA מיקרומטר, 0.6 מ&quot;מ dNTPs, 0.2 מ&quot;מ ATP ו CTP (כולל 0.5 MCI / מ&quot;ל [α- 32 P] CTP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 400 μL של פתרון B, המכיל חיץ 1x ו -20 מ&quot;מ MgCl 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבצע של מכשיר זרימה מהירה-להרוות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ראפמכשיר זרימה id-להרוות; לאחר הופעת התפריט הראשי, הקלד 7 במקלדת המכשיר כדי להזיז את נהג המזרק לעמדת המוצא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ מזרק להרחיב בעמדה &quot;עומס&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרקי חיץ טוען <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף חוצץ המכיל מזרק 10 מ&quot;ל לנמל מזרק הכונן. שינוי מיקום ידית מזרק כדי &quot;לטעון&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 10 מזרקים מ&quot;ל, למלא מאגר חיץ מכשיר ו- B עם 10 מ&quot;מ טריס, pH 7.5, 1 mM EDTA ולמלא מזרק C עם פתרון להרוות (250 מ&quot;מ EDTA, ו -0.2% SDS). הסר בועות אוויר על ידי דחיפת בוכנות פנימה והחוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידית שינוי עמדות &quot;אש&quot;. סוג 2 כדי לשנות את מיקום של בר נהג מזרק. לחץ &quot;להתאים DOWN&quot; על מנת להקטין את המזרק עד חיץ יוצא לולאת היציאה: (7-יורדים ברציפות; צעד גדול 8 למטה; 9-קטן צעד למטה). הקלד &quot;ESC&quot; כדי לחזור לתפריט הראשי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות Wash <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עו&quot;דאח היציאה בתור ואקום. שנת ידיות מדגם &quot;סומק&quot;. מזרק חיץ לסגור על ידי קביעת הידיות למצב האופקי. הפעל ואקום לטבול 2 לולאות הסומק H 2 O עבור 10 s, ואז לטבול MeOH במשך 10 שניות. ניקוי לולאות ידי מציצת אוויר עבור ~ 15 שניות, או עד יבש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות טוענים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום ידית מדגם שנה &quot;עומס&quot;. מניחים פתרון לתוך מזרק 1 מ&quot;ל. חבר מזרק לתוך לאחת מיציאות עומס המדגם. חזור על הפעולה עבור פתרון B, ומניחים בנמל עומס מדגם ההפך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוסף של נקודות זמן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתפריט הראשי, מסוג 1 לריצה להרוות-זרימה. זן זמן תגובה (ים) ולחץ &quot;ENTER&quot;. מספר לולאת התגובה להשתמש יוצג. Switch to לולאת תגובה הנדרשת. הליך חזור על לשטוף בשלב 2.2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מדגם ידיות &quot;לטעון&quot;. תגובה טען מתערבבת לולאות מדגם עד ממש מחוץ לתא הערבוב המרכזי. הפעל את כל הכפתורים כדי &quot;FIRE &quot;. מוודא שכל הכפתורים נמצאים בעמדה הנכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח 1.5 מיליליטר מתחנת רכבת תחתי לתוך סוף לולאת יציאה. לחץ &quot;GO&quot; כדי להפעיל את התגובה. הליך חזור על לשטוף בשלב 2.2.4. מזרקי חיץ רענן A ו- B עד שהם להכות את הנהג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזרו על שלבי 2.2.6.2-2.2.6.3 עבור כל נקודת זמן רצויה. יוצא מן הכלל: אל תטען תמיסה המכילה מגיב ההתחלה (כלומר, MgCl 2 במקרה זה) כאשר מרווה השליטה אפס זמן נקודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום איסוף דגימות, הזן &quot;ESC&quot; כדי לחזור לתפריט הראשי. לחץ &quot;7&quot; כדי לחזור נהג מזרק חיץ לעמדת המוצא שלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשיר לניקוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור מזרקי תערובת תגובה. הפעל ידית טעינה מדגם למצב &quot;עומס&quot;. תחת ואקום, לשטוף כל לולאה המדגם עם 10 מ&quot;ל 0.2 N NaOH, ואחריו 10 מ&quot;ל 0.3 NH 3 PO 4 ו -10 מ&quot;ל MeOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל ידיות מזרק למצב &quot;עומס&quot;. לחץ כלפי מטה על כל 3 SYRבוכנות אינגה לאחזר מאגרי תגובה להרוות. לשטוף מזרקים עם 5 מ&quot;ל H 2 O לפחות פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מזרקים שוב עם 5 מ&quot;ל H 2 O ולהפוך ידיות למצב &quot;אש&quot;. שינוי עמדות כפתור ולהדליק ואקום כדי להסיר H 2 O. Flush כמו בשלב 2.2.4. כבה המכשיר. הערה: מוצרים מנותחים כמתואר בשלבים 1.7-1.12. בנוסף, DNA פולימרז T7 וחלבונים שכפול אחרים ניתן להוסיף לתערובת התגובה לנתח את השפעתם על סינתזה פריימר או הרחבה. </li></ol></li></ol> 3. תגובת סינתזת פריימר חד מחזור הערה: סינתזת פריימר חד מחזור / מבחני הרחבה מתבצעים באופן דומה לתגובות מרובה-מחזור, עם הבדלים גדולים כמה: מבחנים אלה בצעו את ההמרה של ה- ATP רדיואקטיבי לתוך מוצרים פריימר או רחבה, אולם ריכוז המצעים וחלבונים הם consideraבליי גבוה. בנוסף, על מנת להשיג ברזולוציה אלפית השנייה כדי לאפשר ניתוח של סינתזת התגובה פריימר, אחד חייב לנצל מכונת זרימה מהירה-להרוות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תערובות תגובה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 400 μL של פתרון, המכיל חיץ 1x, 3 מיקרומטר hexamer gp4, 6 תבנית ssDNA מיקרומטר, 0.6 מ&quot;מ dNTPs, 1 מ&quot;מ CTP, ו -2 ננומטר [γ- 32 P] ATP. הכן 400 μL של פתרון B, המכיל חיץ 1x ו -20 מ&quot;מ MgCl 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבצע זרימה מהיר-להרוות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע תגובות כמתוארות בשלב 2.2. אם תרצה בכך, להוסיף פולימראז T7 DNA או T7 חד גדילי ה- DNA חלבון מחייב בריכוז של 15 מיקרומטר ו 20 מיקרומטר, בהתאמה. במקרה זה, את המוצרים הרחבים להצטבר משטר זמן המאפשר דגימה ידנית של התגובה. </li></ol></li></ol> ניתוח 4. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקומות התקדמות מוצר לנכונות שאינו ליניארי least-מודלי ריבועים באמצעות תוכנה זמינה מסחרי מסוגלים ריבועים לפחות מתאימים ו / או אינטגרציה נומרית. הפרטים של המבצע ישתנו עם התוכנה מועסקת, אך להלן צורות כלליות של משוואות המשמשות התאמת הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את קצב היווצרות התוצר של תגובות סינתזת פריימר מספר המחזור ידי ההתאמה להתקדם עקומות למשוואה ליניארית. אם יש עיקום ניכר, השתמש בשיטת שיעורו הראשונית 13, 14 על ידי התאמת הנתונים לפונקציה יחידה מעריכים: y = A (e - t k), כאשר y הוא ריכוז המוצר, A היא משרעת התגובה, k הוא הקבוע לקצב המהיר שנמדד בטלסקופים, t הוא הזמן, בשניות. השיפוע של המשיק בשלב = 0 הוא השיעור הראשוני. הערה: Fit טרום יציב תגובות סינתזת פריימר מדינת משוואה ליניארית או למשוואה טרום יציבה פרץ מדינת Y = A (e - k buהראשון t) + שיעור ss t, כאשר A הוא משרעת התגובה, פרץ k הוא קבוע קצב ציין עבור פרץ במצב טרום יציב, ss השיעור הוא ss שיעור היציב = חתול k [אנזים]), t הוא הזמן , בשניות. התאם תגובות סינתזת פריימר חד מחזור להתקדם עקומות על יחיד מעריכי פונקציה y = A (ה - k t). במקרה של gp4, להתאים את הנתונים על ידי אינטגרציה נומרית 15, למודל עם שלושה שלבי עיבוי NTP, כאשר כל ביניים נמצאים בשיווי משקל עם האנזים, באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי. </li></ol>

<ol>
	<li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA replication. , (1992).</li><li>Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motors,+switches,+and+contacts+in+the+replisome.">Motors, switches, and contacts in the replisome.</a> Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).</li><li>Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+bacteriophage+T7+gene+4+proteins+in+providing+primase+and+helicase+functions+in+vivo.">Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).</li><li>Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+initiation+and+extension+by+T7+DNA+primase.">Primer initiation and extension by T7 DNA primase.</a> EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).</li><li>Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+architecture+of+the+bacteriophage+T7+primase+couples+RNA+primer+synthesis+to+DNA+synthesis.">Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis.</a> Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).</li><li>Kusakabe, T., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+4+DNA+primase+of+bacteriophage+T7+mediates+the+annealing+and+extension+of+ribo-oligonucleotides+at+primase+recognition+sites.">Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites.</a> J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).</li><li>Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+sequence-specific+template+binding+by+the+DNA+primase+of+bacteriophage+T7.">Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7.</a> Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).</li><li>Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+release+is+the+rate-limiting+event+in+lagging-strand+synthesis+mediated+by+the+T7+replisome.">Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).</li><li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides.">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li><li>Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+the+bacteriophage+T7+gene+2.5+protein.+A+single-stranded+DNA-binding+protein.">Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein.</a> J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).</li><li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+primases.">DNA primases.</a> Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).</li><li>Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+lysine+residues+in+the+RNA+polymerase+domain+of+the+gene+4+primase-helicase+of+bacteriophage+T7.">Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7.</a> J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).</li><li>Cao, W., De La Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+full+time+course+analysis+of+nonlinear+enzyme+cycling+kinetics.">Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics.</a> Sci Rep. 3, 2658 (2013).</li><li>Wang, M. H., Zhao, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+determining+kinetic+constants+of+complexing+inactivation+at+identical+enzyme+and+inhibitor+concentrations.">A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations.</a> FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer.">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).</li><li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+century+of+enzyme+kinetic+analysis,+1913.">A century of enzyme kinetic analysis, 1913.</a> FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).</li><li>Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG.">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).</li><li>Sanyal, G., Doig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+DNA+replication+enzymes+as+targets+for+antibacterial+drug+discovery.">Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הגורם החשוב ביותר בביצוע הניסויים אלה הוא הזמינות של אנזים מטוהר מאוד פעיל. במהלך עבודתנו עם gp4, למשל, מצאנו אחסון של האנזים מטוהרים חיץ (פוספט אשלגן 20 מ&quot;מ, pH 7.4, 0.1 EDTA מ&quot;מ, 1 מ&quot;מ DTT) המכיל גליצרול 50% ב -20 ° C מוביל לירידה ב הפעילות הספציפית של התכשיר על פני כמה חודשים. ל...

השכפול של הדנ&quot;א הוא תכונה נשמרת כל החיים התאיים. בעוד הזהות ומספר הרכיבים שכפולים להשתנות משמעותית, המנגנונים הכלליים משותפים בין אבולוצית 1. כאן אנו מתארים מבוססים-ג&#39;ל, ניסויים קינטיים רציפים, באמצעות מצעים רדיואקטיבי, להבנת קינטיקה של סינתזת DNA גדיל מפגר במבחנה על ידי רכיבים של replisome T7. המנגנון שכפול של T7 bacteriophage הוא פשוט מאוד, המורכב רק ארבעה חלבונים (פולימראז DNA, gp5, והגורם שלה processivity, thioredoxin החיידק, את gp4 primase-helicase bifunctional, ואת החלבון חד גדילי הדנ&quot;א מחייב, GP2. 5) 2. תכונה זו עושה את זה מערכת מודל אטרקטיבית כדי לחקור את המנגנונים הביוכימיים המשומרים מעורבים שכפול הדנ&quot;א. דגש מיוחד מושם על היווצרות של פריימרים ribonucleotide ידי DNA T7 primase, critical צעד בייזום של סינתזה של DNA. בנוסף, אפשר גם לבחון את השימוש של פריימרים אלה על ידי פולימראז T7 DNA או חלבונים שכפולים אחרים על ידי כולל אותם לתערובת התגובה. T7 primase-helicase, gp4, מזרז היווצרות של פריימרים עבור סינתזה של DNA על רצפי DNA ספציפי הנקרא אתרי הכרה primase, או PRS, (5&#39;-GTC-3 &#39;). ציטוזין ב PRS הוא נסתר, זה הכרחי להכרה של האתר, אבל זה לא מועתק לתוך המוצר 3. הצעד הראשון סינתזה פריימר ידי gp4 כרוך היווצרות של dinucleotide pppAC, אשר ניתנת להארכה אז אל trimer, ובסופו של דבר פריימרים tetranucleotide פונקציונלי pppACCC, pppACCA, או pppACAC תלוי רצף בתבנית 4. פריימרים אלו לאחר מכן ניתן להשתמש על ידי פולימראז T7 DNA ליזום סינתזת ה- DNA, שהוא גם תהליך 5 בסיוע gp4, 6. בהקשר זה, primaseתחום מייצב את tetraribonucleotides הקצר מאוד עם התבנית, מניעת דיסוציאציה שלהם, עוסק DNA פולימרז באופן הדרך להבטיח פריימר / תבנית לתוך פולימראז האתר פעיל 7. צעדים אלה (סינתזת פריימר RNA, handoff פריימר כדי פולימראז, ורחבה) חוזרים מחזורים רבים לשכפל הגדיל המפגר חייבים להיות מתואם עם השכפול של הגדיל המוביל. המבחנים המתוארים כאן הם רגישים מאוד והוא יכול להתבצע בתוך מסגרת זמן מתונה. עם זאת, הם נמוכים יחסית תפוקה ו בזהירות רבה יש מבוצעת השימוש וסילוק חומרים רדיואקטיביים. תלוי במהירות שבה היא מתרחשת, אפשר להעסיק מכשיר מהיר-להרוות להשיג דגימות בסקלות הזמן נוחות עבור ניתוח משמעותי של קורסי זמן תגובה כלשהי באחד משני יציבה או במצב טרום היציב. לאחרונה, השתמשנו מבחנים המתוארים כאן כדי לספק evidencדואר לחשיבות שחרור פריימר מהתחום primase של gp4 בייזום של שברי Okazaki. בנוסף, מצאנו עדויות של תפקיד רגולטורי עבור דנ&quot;א חד-גדילי T7 חלבון מחייב, gp2.5, בקידום היווצרות פריימר יעיל וניצול 8.

<table><tbody><tr><td>Tris pre-set crystals&lt;br/&gt; pH 7.5</td><td>SIGMA</td><td>T4128</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>SIGMA</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td><td>SIGMA</td><td>G1501&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>J.T. Baker</td><td>F780-02</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate</td><td>MP Biomedicals</td><td>811030</td><td></td></tr><tr><td>(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4931-04</td><td></td></tr><tr><td>[&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] CTP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU508H</td><td>radioactive, take protective measures</td></tr><tr><td>[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P] ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td>radioactive, take protective measures</td></tr><tr><td>100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&amp;nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>77100</td><td>four dNTPs part of set</td></tr><tr><td>100 mM ATP and CTP</td><td>Epicentre</td><td>RN02825</td><td>part of NTP set</td></tr><tr><td>ssDNA constructs</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>custom sequences&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>methanol&amp;nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3017-08</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>SIGMA</td><td>B8026&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cylene xyanol&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>X4126&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>acrylamide</td><td>SIGMA</td><td>A9099</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-Methylenebisacrylamide</td><td>SIGMA</td><td>M7279&amp;nbsp;</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>2549</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Quench-Flow Instrument&amp;nbsp;</td><td>Kintek Corp.</td><td>RQF-3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kintek Explorer</td><td>Kintek Corp.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph&amp;nbsp;</td><td>Synergy Software</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

kinetics of lagging-strand dna synthesis in vitro by the bacteriophage t7 replication proteins

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

התוצאות שמוצגות באיור 1A התקבלו כמתואר בשלב 1 של הפרוטוקול, כלומר, באמצעות דגימה ידנית תגובת סינתזת פריימר מזורזת על ידי gp4 בתנאים מרובה מחזור. הנה, מגוון של מוצרים לאחר ג&#39;ל אלקטרופורזה ניתן לצפות באמצעות CTP שכותרתו עם 32 ...

Watch this Scientific Journal Video about Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins at JoVE.com

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

קינטיקה של סינתזת DNA מפגר גדיל<em&gt; במבחנה</em&gt; על ידי חלבונים שכפול bacteriophage T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

kinetics-lagging-strand-dna-synthesis-vitro-bacteriophage-t7

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Genetics

Unit 1

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Replication

SCIENTISTS IN ACTION

7.3K Views.  Harvard Medical School. We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7. 

Video: Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. The binding of prokaryotic DnaG-like primases to DNA occurs at a specific trinucleotide recognition sequence. It is a pivotal step in the formation of Okazaki fragments. Conventional biochemical tools that are used to determine the DNA recognition sequence of DNA primase provide only limited information. Using a high-throughput microarray-based binding assay and consecutive biochemical analyses, it has been shown that 1) the specific binding context (flanking sequences of the recognition site) influences the binding strength of the DNA primase to its template DNA, and 2) stronger binding of primase to the DNA yields longer RNA primers, indicating higher processivity of the enzyme. This method combines PBM and primase activity assay and is designated as high-throughput primase profiling (HTPP), and it allows characterization of specific sequence recognition by DNA primase in unprecedented time and scalability.&#160;

Protein binding microarray (PBM) experiments combined with biochemical assays link the binding and catalytic properties of DNA primase, an enzyme that synthesizes RNA primers on template DNA. This method, designated as high-throughput primase profiling (HTPP), can be used to reveal DNA-binding patterns of a variety of enzymes.

זיהוי רצף דנ א על ידי Primase DNA שימוש בתפוקה גבוהה Primase פרופיל

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Biochemistry

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biology

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA polymerase (RNAP) following a head-on collision is unknown. Here, we find that the E. coli replisome stalls upon collision with a head-on transcription complex, but instead of collapsing, the replication fork remains highly stable and eventually resumes elongation after displacing the RNAP from DNA. We also find that the transcription-repair coupling factor, Mfd, promotes direct restart of the fork following the collision by facilitating displacement of the RNAP. These findings demonstrate the intrinsic stability of the replication apparatus and a novel role for the transcription-coupled repair pathway in promoting replication past a RNAP block.

The fate of the replisome following a collision with a head-on RNA polymerase (RNAP) is unknown. We find that the replisome stalls upon collision with a head-on RNAP, but resumes elongation after displacing the RNAP from DNA. Mfd promotes replication restart by facilitating displacement of the RNAP after the collision.

הפעל מחדש ישיר של מזלג שכפול בדמותה של פולימראז RNA חזיתית

In vivo studies suggest that replication forks are arrested due to encounters with head-on transcription complexes. Yet, the fate of the replisome and RNA ...

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel capabilities to perform basic and applied sciences in test tube reactions. Over the past decade, cell-free TXTL has become a powerful technique for a broad range of novel multidisciplinary research areas related to quantitative and synthetic biology. The new TXTL platforms are particularly useful to construct and interrogate biochemical systems through the execution of synthetic or natural gene circuits. In vitro TXTL has proven convenient to rapidly prototype regulatory elements and biological networks as well as to recapitulate molecular self-assembly mechanisms found in living systems. In this article, we describe how infectious bacteriophages, such as MS2 (RNA), &#934;&#935;174 (ssDNA), and T7 (dsDNA), are entirely synthesized from their genome in one-pot reactions using an all Escherichia coli, cell-free TXTL system. Synthesis of the three coliphages is quantified using the plaque assay. We show how the yield of synthesized phage depends on the biochemical settings of the reactions. Molecular crowding, emulated through a controlled concentration of PEG 8000, affects the amount of synthesized phages by orders of magnitudes. We also describe how to amplify the phages and how to purify their genomes. The set of protocols and results presented in this work should be of interest to multidisciplinary researchers involved in cell-free synthetic biology and bioengineering.

Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System

A new generation of cell-free transcription-translation platforms has been engineered to construct biochemical systems in vitro through the execution of gene circuits. In this article, we describe how bacteriophages, such as MS2, &#934;&#935;174, and T7, are synthesized from their genome using an all E. coli cell-free TXTL system.

סינתזה של Bacteriophages זיהומיות e. coli -תא ללא ביטוי מערכת מבוססת

A new generation of cell-free transcription-translation (TXTL) systems, engineered to have a greater versatility and modularity, provide novel ...

Bioengineering

Quantitative PCR of T7 Bacteriophage from Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a fluorescence-based approach to quantify DNA, and here, it is adapted to quantify phage genomes as a proxy for phage particles. In this protocol, a facile phage DNA preparation method is described using high-temperature heating without additional DNA purification. The method only needs small volumes of heat-treated phages and small volumes of the qPCR reaction. qPCR is high-throughput and fast, able to process and obtain data from a 96-well plate of reactions in 2&#8211;4 h. Compared to other phage enumeration approaches, qPCR is more time-efficient. Here, qPCR is used to enumerate T7 phages identified from biopanning against in vitro cystic fibrosis-like mucus model. The qPCR method can be extended to quantify T7 phages from other experiments, including other types of biopanning (e.g.,&#160;immobilized protein binding, in vivo phage screening) and other sources (e.g., water systems or body fluids). In summary, this protocol can be modified to quantify any DNA-encapsulated viruses.

A reproducible, accurate, and time efficient quantitative PCR (qPCR) method to enumerate T7 bacteriophage is described here. The protocol clearly describes phage genomic DNA preparation, PCR reaction preparation, qPCR cycling conditions, and qPCR data analysis.

PCR כמותי של T7 Bacteriophage מ- Biopanning

This protocol describes the use of quantitative PCR (qPCR) to enumerate T7 phages from phage selection experiments (i.e., &#34;biopanning&#34;). qPCR is a ...

Immunology and Infection

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of oligonucleotides in biotechnology and synthetic biology. Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates have historically been prepared in vitro by enzymatic methods. However, these methods are limited to natural RNA oligonucleotides, have strong sequence preferences, and tend to produce heterogeneous products. New methods of chemical triphosphorylation complement both the reduced cost of automated oligonucleotide synthesis by phosphoramidite chemistry and the diverse range of nucleotide modifications now available. Thus, the synthesis of oligonucleotide triphosphates of arbitrary sequence and length, and optionally containing various nonnatural modifications, is now accessible.
This paper presents the appropriate methods and techniques for chemical triphosphorylation of oligonucleotides using salicyl phosphorochloridite and pyrophosphate. This method uses commercially available reagents, is compatible with most oligonucleotides prepared by standard solid-phase synthesis methods, and can be completed in 2 h following oligonucleotide synthesis, before deprotection and purification. Two uses of chemically triphosphorylated oligonucleotides as substrates for catalytic RNA enzymes are demonstrated, including the synthesis of a mirror-image version of the hammerhead ribozyme from nonbiological L-RNA triphosphates.

Oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates are ubiquitous components in essential biological pathways and have seen increasing use in biotechnology applications. Here, we describe techniques for the routine synthesis and purification of oligonucleotide 5&#8242;-triphosphates, starting from oligonucleotides prepared by standard automated synthesis techniques.

טריפוספורילציה כימית של אוליגונוקלאוטידים

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

חקר דינמיקה של חיידקי פאג'-מעיים במודלים של מורין באמצעות פאגים מסוג T4

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across all known ecosystems. Within bacterial communities, such as those found in the gut microbiota, phages are implicated in regulating microbiota population dynamics and driving bacterial evolution. There has been renewed interest in phage research in the last decade, in part due to the host-specific killing capabilities of lytic phages, which offer a promising tool to counter the increasing threat of antimicrobial resistant bacteria. Furthermore, recent studies demonstrating that phages adhere to intestinal mucus suggest they may have a protective role in preventing bacterial invasion into the underlying epithelium. Importantly, like bacterial microbiomes, disrupted phageomes have been associated with worsened outcomes in diseases such as inflammatory bowel disease. Previous studies have demonstrated that phages can modulate the microbiome of animals and humans through fecal filtrate transplants, benefiting the host&#39;s health. With this recent wave of research comes the necessity to establish and standardize protocols for studying phages in the context of the gut microbiome. This protocol provides a set of procedures to study isolated T4 phages and their bacterial host, Escherichia coli,&#160;in the context of the murine gastrointestinal tract. The methods described here outline&#160;how to start from a phage lysate, administer it to mice and assess effects on bacterial host and phage levels.&#160;This protocol can be modified and applied to other phage-bacterial pairs and provides a starting point for studying host-phage dynamics in vivo.

מחבר זרקור: חקירת תגובות חיסוניות המושרות על ידי בקטריופאג'ים בעכברים גנוטוביוטיים

Bacteriophages (phages), viruses that infect bacteria, are an integral component of the gut microbiome. Though these symbiotic inhabitants drive bacterial fitness and population dynamics, little is understood about how they impact gut homeostasis and disease. This protocol studies isolated T4 phages within a mouse model, adaptable to other phage-bacterial pairs.

אינטראקציה בין בקטריופאג' T4 ואי קולי במעי מורין: מודל אב-טיפוסי לחקר דינמיקה של בקטריופאג' מארח ב-Vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

קינטיקה של סינתזת DNA מפגר גדיל

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

זיהוי רצף דנ א על ידי Primase DNA שימוש בתפוקה גבוהה Primase פרופיל

חזותי יחיד מולקולת הדנ"א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

הפעל מחדש ישיר של מזלג שכפול בדמותה של פולימראז RNA חזיתית

סינתזה של Bacteriophages זיהומיות e. coli -תא ללא ביטוי מערכת מבוססת

PCR כמותי של T7 Bacteriophage מ- Biopanning

טריפוספורילציה כימית של אוליגונוקלאוטידים

אינטראקציה בין בקטריופאג' T4 ואי קולי במעי מורין: מודל אב-טיפוסי לחקר דינמיקה של בקטריופאג' מארח ב-Vivo

אינטראקציה בין בקטריופאג' T4 ואי קולי במעי מורין: מודל אב-טיפוסי לחקר דינמיקה של בקטריופאג' מארח ב-Vivo

אינטראקציה בין בקטריופאג' T4 ואי קולי במעי מורין: מודל אב-טיפוסי לחקר דינמיקה של בקטריופאג' מארח ב-Vivo