これらの方法は、生体材料の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。特に骨再生のため。彼らは、生体材料の有効性と潜在的な免疫応答を評価するために使用されます。
この学際的なプラットホームの主な利点は骨の修理のために使用される生物材料の生物適合性を予測するための変数の範囲を提供する。これらのインビトロおよびインビボ骨技術の意味合いは、他の骨疾患にまで及ぶ。新しい整形外科生体材料の前臨床スクリーニングの必要性のため。
皮膚科の方法論は骨の治癒のための生体材料への洞察を提供することができ、それはまた、他の臨床適応症のための生体材料評価に適用することができる。骨形成性無機化培地を添加した14日後の原発性骨芽細胞からの吸気培地。1X PBSの0.5ミリリットルで2回リンス。
その後、10%緩衝ホルマリン溶液の0.5ミリリットルを加え、室温で10分間インキュベートして細胞を固定します。10分後、10%緩衝ホルマリンを使い捨てパイプで吸引し、0.5ミリリットルの超純水で2回洗浄する。その後、固定骨芽細胞に40ミリモルアリザリンレッドS染色液の250マイクロリットルを追加します。
そして、毎分100シェイクでシェーカーで10分間室温でプレートをインキュベートします。染色液でインキュベーションした後、1ミリリットルの超純水で1ミリリットルの極純水で染色液を吸引する。リンス溶液が透明になるまで、このステップを5~10回繰り返して非特異的染色を除去します。
最後の洗浄を吸引した後、冷たいPBSの1ミリリットルを追加します。そして、以前のようにシェーカー上で10分間室温でプレートをインキュベートします。次に、染色されたβ三カルシウムリン酸ディスクを新しいウェルに移し、フラットベッドスキャナでプレートをスキャンして鉱物化を記録します。
画像を取り込んだ後、250マイクロリットルの10%セチルピリジニウムクロリド溶液を加え、15分間振ってアリザリンレッドS染料を抽出します。次に、溶液をウェルから個々の1.5ミリリットルチューブ、遠心分離機を室温で5分間17,000 x gに移します。10%セチルピリジニウムクロリド溶液で抽出物を1.5ミリリットルチューブで1:10〜1:20の希釈度で希釈します。
その後、各希釈サンプルの300マイクロリットルを96ウェルプレートのウェルに移します。塩化10%のセチルピリジニウムのみを含む2つのブランクウェルを含む。次に、40ミリオモラルアリザリンレッドS染色液を10%セチルピリジニウムクロリド溶液で希釈して4400マイクロモルからなる7つのアリザリンレッドS基準基準を調製し、標準曲線を生成する。
各標準の300マイクロリットルをプレートに積み込みます。最後に、520ナノメートルのサンプル、ブランク、および基準規格の吸収剤を読み取ります。骨髄破骨形成体を、生殖不能はさみを使用して股関節の体から脚を取り除くことによって、安楽死させたマウスの大腿骨および脛骨から骨髄骨形成前駆体を分離する。
膝と足首の関節で手足を切断し、無菌メスと鉗子で柔らかい組織を取り除きます。骨端を切り落とす。1ミリリットルの骨成長培地で満たされた注射器に取り付けられた27ゲージの針を内腔に挿入し、骨髄を6センチメートルの無菌ペトリ皿に洗い流します。
すべての大腿骨と脛骨のためにこれを繰り返した後、50ミリリットルの円錐形チューブに細胞懸濁液を移す。6センチのペトリ皿を5ミリリットルの骨成長培地で洗い、同じ50ミリリットルの円錐形チューブに移します。摂氏4度で350xgの遠心分離機を5分間。
遠心分離後、破骨細胞分化培地のウェル当たり1ミリリットルで細胞を再懸濁する。1つのBALB/cマウスは、1つの24ウェル培養プレートに十分な数の破骨前駆体を提供します。骨成長培地に懸濁した原発骨芽細胞を生体材料に加え、コントロールを8.8*10^4平方センチメートルでコントロールします。
ベータ三カルシウムリン酸ディスク、制御された牛の骨、および組織培養プラスチックがここでは使用されます。24時間の5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートします。24時間後、培養した原発性骨芽細胞に新たに単離した骨髄破骨前駆体前駆体および破骨細胞分化培地を加え、5%の二酸化炭素で摂氏37度で5日間培養してインキュベーターに戻す。
培地を1日おきに作りたての破骨細胞分化培地に交換してください。次いで、酒類耐性酸ホスファターゼの破骨細胞を染色し、分化を評価する。麻酔付き8週齢BALB/cマウスの頭皮を剃り、7.5%ポビコーンヨウ素溶液と70%エタノールで表面をきれいにします。
眼用軟膏で目を覆い、処置中の乾燥を防ぎます。つま先と尾のピンチに対する反応の欠如によって麻酔の適切なレベルを確保します。その後、正中線矢状切開を行った後、メスで掻き取ることによって、右頭頂骨の上のパラクラニウム結合組織を除去する。
その後、毎分2000回転で直径4ミリメートルの無菌歯科トレフィンを使用して、右頭頂骨に重大な大きな欠陥を作り出します。常に右頭頂骨をノッチし、エクトコールテキストといくつかの内皮質を切断しながら、滅菌生理食い溶液で領域を灌漑.デラ・マーターの損傷を防ぐために、小さなペリオスチールエレベーターを使用して残りの内皮質を突破します。
その後、慎重にカルバリア骨を持ち上げ、それを削除するために鉗子を使用しています。結果として生じる欠陥は円形で、直径は約3.5ミリメートルである必要があります。次に、カルバリア欠損物を、滅菌PBSに予め浸した、ベタクロリン酸三カルシウムコラーゲンフォームで満たす。
生体材料を所定の位置に保つために、欠陥の端に0.5マイクロリットルの組織接着剤を2つの反対のポイントで塗布します。その後、非吸収性縫合糸で皮膚を閉じます。麻酔したマウスを背中に置き、腹部の毛皮を剃り、7.5%ポビドンヨウ素溶液と70%エタノールで剃った表面をきれいにします。
腹部のリニアアルバに沿って皮膚を通して8ミリメートルの長い中線切開を行った後、移植PBSは皮膚の下に生体物質を浸した。次に、非吸収性縫合糸で皮膚を縫合する。移植後8週間、安楽死させたマウスから周囲の組織で移植部位を切除する。
この画像は、オープンバーに示されたベータ三カルシウムリン酸ディスクの成長が、培養7日および14日の培養プラスチックの成長と比較して骨芽細胞の生存率に影響を与えないことを示している。培養骨芽細胞は14日後にアリザリンレッドSで染色された。ミネラル化は、培地単独で培養した骨芽細胞に比べて、鉱化培地の制御に対して高かった。
そして、懸濁液培養井戸中のベータ三カルシウムリン酸ディスクに。外科的に誘発された重篤な大きさのカルバリア欠損を空にした場合、全欠陥を覆う薄い層が観察されたが、手術後12週で有意な骨形成は存在しなかった。対照的に、欠損がリン酸三カルシウムコラーゲン発泡体のβを含む場合、いくつかの血管および炎症細胞を含む密な線維組織に囲まれた泡残骸は、骨形成の証拠なしに欠陥領域を橋渡しした。
皮下ベータ三カルシウムリン酸コラーゲンフォーム移植に続いて、ヘマトキシリンおよびエオシン染色切片に対する異物巨細胞に対する炎症反応が8週間でマッソンのトリクローム染色切片に線維症の証拠を観察した。対照的に、恥のコントロールの移植部位は、最小限の炎症と線維症を有していなかった。この手順を試みている間、それは動物を傷つけることなく、カルバリウムの正確かつ再現性のノッチを行うことが重要です。
この手順の他の方法に従って、破骨細胞分化アッセイや腹膜免疫モデルへの高スループットは、生体材料に対する破骨細胞の応答および免疫応答の種類のような追加の質問に答えるために前形化することができる。
