Questi metodi possono aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo dei biomateriali. In particolare per la rigenerazione ossea. Sono usati per valutare l'efficacia dei biomateriali e le potenziali risposte immunitarie.
Il vantaggio principale di questa piattaforma multidisciplinare è che fornisce una serie di parametri per prevedere la biocompatibilità dei biomateriali utilizzati per la riparazione ossea. Le implicazioni di queste tecniche ossee in vitro e in vivo si estendono verso altri disturbi ossei. A causa della necessità di screening preclinico di nuovi biomateriali ortopedici.
La metodologia dermatologica può fornire approfondimenti sui biomateriali per la guarigione ossea, può anche essere applicata alle valutazioni dei biomateriali per qualsiasi altra indicazione clinica. Aspirare il mezzo di coltura dagli osteoblasti primari 14 giorni dopo l'aggiunta del mezzo di mineralizzazione osteogenica. Risciacquare due volte con 0,5 millilitri di 1X PBS.
Quindi fissare le cellule aggiungendo 0,5 millilitri di soluzione di formalina tamponata al 10% e incubando a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo 10 minuti, aspirare la formalina tamponata al 10% con una pipetta monouso e lavare due volte con 0,5 millilitri di acqua ultrapura. Quindi aggiungere 250 microlitri di 40 millimolare alizarin soluzione di colorazione rossa agli osteoblasti fissi.
E incubare il piatto a temperatura ambiente per 10 minuti su uno shaker a 100 frullati al minuto. Dopo l'incubazione con soluzione di colorazione, aspirare la soluzione di colorazione con una pipetta monouso e risciacquare con un millilitro di acqua ultrapura. Ripetere questo passaggio da cinque a 10 volte fino a quando la soluzione di risciacquo non viene chiara per rimuovere la colorazione non specifica.
Dopo aver aspirato il lavaggio finale, aggiungere un millilitro di PBS freddo. E incubare il piatto a temperatura ambiente per 10 minuti su uno shaker come prima. Successivamente, trasferire i dischi di fosfato beta tricalcium macchiato in un nuovo pozzo e scansionare le piastre con uno scanner piano per registrare la mineralizzazione.
Dopo l'acquisizione dell'immagine, aggiungere 250 microlitri di soluzione di cloruro di cetilpiridinio al 10% e agitare per 15 minuti per estrarre il colorante Alizarin Red S. Successivamente, trasferire la soluzione dai pozzi ai singoli tubi da 1,5 millilitri e centrifugare a 17.000 x g per cinque minuti a temperatura ambiente. Diluire l'estratto con soluzione di cloruro di cetilpiridinio al 10% con una razione di diluizione da 1:10 a 1:20 in un tubo da 1,5 millilitri.
Quindi trasferire 300 microlitri di ogni campione diluito nei pozzi della piastra da 96 pozzi. Includere due pozzi vuoti contenenti solo cloruro di cetilpiridinio al 10%. Successivamente, preparare sette standard di riferimento Alizarin Red S che vanno da 4 400 micromolari diluendo 40 milliomolare soluzione di colorazione Alizarin Red S con soluzione di cloruro di cetilpiridinio al 10% per generare una curva standard.
Caricare 300 microlitri di ogni standard nella piastra. Infine, leggere gli assorbenti dei campioni, degli spazi vuoti e degli standard di riferimento a 520 nanometri. Isolare i precursori dell'osteoplasto del midollo osseo dai femori e dalle tibiae di un topo eutanasiato utilizzando forbici sterili per rimuovere le gambe dal corpo all'articolazione dell'anca.
Tagliare gli arti alle articolazioni del ginocchio e della caviglia e rimuovere il tessuto molle con bisturi sterile e forcelle. Taglia le epifisi. Inserire un ago calibro 27 attaccato a una siringa riempita con un millilitro di mezzo di crescita ossea nel lume e sciacquare il midollo in una piastra di Petri sterile di sei centimetri.
Dopo aver ripetuto questo per tutti i femori e le tibiae, trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri. Lavare la piastra di Petri di sei centimetri con cinque millilitri di mezzo di crescita ossea e trasferirla nello stesso tubo conico da 50 millilitri. Centrifuga a 350 x g a quattro gradi Celsius per cinque minuti.
Dopo la centrifugazione sospendere le cellule in un millilitro per pozzo di mezzo di differenziazione osteoclasta. Un topo BALB/c fornisce un numero sufficiente di precursori dell'osteoclasta per una piastra di coltura a 24 pozzi. Aggiungere osteoblasti primari sospesi nel mezzo di crescita ossea sul biomateriale e i controlli a 8,8 * 10 ^ 4 cellule per centimetro quadrato.
Qui vengono utilizzati dischi di fosfato beta tricalcium, osso bovino controllato e plastica per la coltura tissutale. Incubare a 37 gradi celsius in anidride carbonica al cinque per cento per 24 ore. Dopo 24 ore, aggiungere precursori osteoclasti del midollo osseo appena isolati e mezzo di differenziazione dell'osteoclasta agli osteoblasti primari coltivati e tornare all'incubatrice per cinque giorni di coltura a 37 gradi celsius al 5% di anidride carbonica.
Sostituire il mezzo con un mezzo di differenziazione osteoclasta appena preparato a giorni diversi. Quindi macchiare gli osteoclasti per la fosfatasi acida resistente ai tartrati per valutare la differenziazione. Radere il cuoio capelluto di un topo BALB/c anestetizzato di otto settimane e pulire la superficie con soluzione di iodio povidone al 7,5% e etanolo al 70%.
Coprire gli occhi con unguento oftalmico per evitare l'asciugatura durante la procedura. Assicurarsi un livello appropriato di anestesia per mancanza di una reazione a un dito del piedi e della coda pizzicare. Quindi, dopo aver fatto un'incisione sagittale della linea mediana, rimuovere i tessuti connettivi del paracranio sopra l'osso parietale destro raschiarlo con un bisturi.
Quindi utilizzare una trephine dentale sterile con un diametro di quattro millimetri a rotazioni 2000 al minuto per creare un difetto di dimensioni critiche nell'osso parietale destro. Irrigare costantemente la regione con una soluzione salina sterile, annotando l'osso parietale destro e tagliando attraverso l'ectocortext e un po 'di endocorteccia. Per evitare danni al Dera Mater, utilizzare un piccolo ascensore periosteale per sfondare l'endocorteccia rimanente.
Quindi utilizzare le forcep per sollevare con cura l'osso calvariale e rimuoverlo. Il difetto risultante deve essere circolare e di circa 3,5 millimetri di diametro. Quindi, riempire il difetto calvariale con schiuma di collagene fosfato beta tricalcium, presoaked in PBS sterile.
Per mantenere il biomateriale in posizione, applicare 0,5 microlitri di adesivo tissutale alla fine del difetto in due punti opposti. Quindi chiudere la pelle con una sutura non assorbibile. Posizionare un topo anestetizzato sulla schiena, radere la pelliccia addominale e pulire la superficie rasata con soluzione di iodio di povidone al 7,5% e 70% di etanolo.
Dopo aver fatto un'incisione della linea mediana lunga otto millimetri attraverso la pelle lungo la linea alba dell'addome, impiantare il biomateriale imbevuto di PBS sotto la pelle. Quindi suturare la pelle con una sutura non assorbibile. Otto settimane dopo l'impianto, asportare il sito di impianto con il tessuto circostante dal topo eutanasiato.
Questa immagine dimostra che la crescita sui dischi fosfati beta tricalcio mostrati in barre aperte non influisce sulla vitalità degli osteoblasti rispetto alla crescita della plastica per coltura tissutale a sette e 14 giorni di coltura. Gli osteoblasti coltivati sono stati macchiati con Alizarin Red S dopo 14 giorni. La mineralizzazione è stata più elevata per i controlli dei mezzi di mineralizzazione rispetto agli osteoblasti coltivati solo a medio.
E sui dischi di fosfato beta tricalcio nei pozzi di coltura delle sospensioni. Quando un difetto calvariale di dimensioni critiche indotto chirurgicamente è stato lasciato vuoto, è stato osservato uno strato sottile che copre l'intero difetto, ma non era presente alcuna formazione ossea significativa a 12 settimane dopo l'operazione. Al contrario, quando il difetto conteneva schiuma di collagene fosfato beta tricalcium, i resti di schiuma circondati da tessuto fibroso denso tra cui alcuni vasi sanguigni e cellule infiammatorie hanno colmato l'area dei difetti senza prove di formazione ossea.
A seguito dell'impianto di schiuma di collagene al beta tricalcio beta tricalcico sottocutaneo, è stata osservata una risposta infiammatoria con cellule giganti del corpo estraneo su sezioni macchiate di ematossilina ed Eosina un'evidenza di fibrosi sulle sezioni macchiate tricromatiche di Masson a otto settimane. Al contrario, il sito di impianto dei controlli fittizi aveva un'infiammazione minima e nessuna fibrosi. Durante il tentativo di questa procedura è importante fare tacca precise e riproducibili del calvario senza ferire l'animale.
Seguendo gli altri metodi di questa procedura come i test di differenziazione osteoclasta e l'elevata produttività nei modelli immunitari peritoneali possono essere preformati al fine di rispondere a domande aggiuntive come la risposta dell'osteoclasta ai biomateriali e il tipo di risposta immunitaria.
