تم تصميم هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الكيمياء الحيوية غير العضوية، حول كيفية الحفاظ على نشاط الإنزيم في البروتينات التي تحتوي على المعادن الحساسة الأكسجين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يساعدك على تصور الطرق التي يمكنك من خلالها الحفاظ على معدن البروتين في حالته المخفضة. عموما، سوف الأفراد الجدد لهذه التقنية النضال لأنه من الصعب الحفاظ على المواد والكواشف لتكون اللاهوائية تماما.
24 ساعة بعد تحريض تعبير البروتين, جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي, وإعادة تعليق بيليه الخلية البكتيرية في 20 ملليلتر من عمود amylose العازلة لكل 1.5 لتر من النمو. إضافة ملليغرام واحد من lysozyme إلى تعليق الخلية، ويحرك الخلايا لمدة 20 دقيقة على الجليد. في نهاية الحضانة ، وlyse محلول الخلية resuspended عن طريق التجانس عالية الضغط مع ثلاثة إلى خمسة تمريرات في حوالي 15000 psi ، ونقل البروتين إلى أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر.
تدفق مساحة الرأس مع النيتروجين لمدة دقيقة واحدة، والطرد المركزي الخلية lysate لإزالة الحطام غير قابلة للذوبان. نقل supernatant إلى واحد على الأقل 50 ملليلتر أنبوب، وغطاء lysate مع الحاجز المطاطي. باستخدام إبرة 20 قياس، فقاعة ببطء غاز النيتروجين من خلال الحل لمدة دقيقتين لإزاحة الأكسجين.
ثم، التفاف الحاجز مع فيلم البارافين، وتأمين Parafilm مع الأسلاك النحاسية، ووضع supernatant في مربع القفازات مع مواد العمود. عندما المذيب هو فقط فوق السرير الراتنج، في عمود amylose أعدت سابقا، تحميل 50 ملليلتر من البروتين سوبرنات على العمود، وجمع تدفق من خلال في كسور خمسة ملليلتر تحت النيتروجين الضغط المعتدل في ما يقرب من خمسة ملليلتر في الدقيقة الواحدة. عندما تم اغصاء كل تدفق من خلال ، وغسل العمود مع وحدات التخزين عمود ثلاثة أخرى من العازلة عمود amylose.
إضافة خمسة السيرة الذاتية من عازلة elution، ومن ثم جمع يدويا كسور ثلاثة ملليلتر في أنابيب اختبار الزجاج تحت النيتروجين المضغوط المعتدل. اختبار الحلول لوجود الأكسجين مع كبريتات الأمونيوم الحديدية وdithiothreitol. الحل سوف تتحول الأزرق الداكن أو الأسود إذا كان الأكسجين موجودا، مثل أنبوب على اليمين.
وجود الأكسجين سوف يؤدي إلى البروتين النقي مع نشاط الحفاز منخفضة. حلول مع الحد الأدنى من الأوكسجين الحالي سيكون الخزامى أو اللون الأزرق الفاتح شفافة، مثل أنبوب على اليسار. بعد ذلك، استخدم خط النيتروجين الخارجي للضغط على غرفة الخلية المُثارة، وتركيز البروتين على 50 ملليلتر بسرعة مثيرة معتدلة مرتين.
ثم، تركيز البروتين إلى 10 ملليلتر، وتصفية البروتين المركز من خلال مرشح حقنة ميكرومتر المسام 0.45. Aliquot 150 ميكرولترات من البروتين إلى فردي 200 ميكرولتر البوليميراز سلسلة أنابيب التفاعل. ثم، إزالة aliquots توج من مربع القفازات لتجميد فلاش الفوري في النيتروجين السائل والتخزين في ناقص 80 درجة مئوية.
لDsB desalting، أولا إضافة ثلاثة ملليلتر من سيفاديكس G-25 جل desalting الخشنة إلى عمود borosilicate تسعة ملليلتر، وغسل العمود مع اثنين من وحدات التخزين العمود من عازلة desalt degassed. عندما يذوب DesB ، قم بتحميل البروتين المنقى على العمود عبر عملية تتحكم فيها الجاذبية ، وتجاهل التدفق من خلال قبل سحب ثلاث قطرات من البروتين في كل من 12 قارورة ، مع ما يقرب من خمسة ملليلترات من عازلة إزالة ماء. لإعداد قطب الأكسجين ، استخدم المقص لقطع واحد حوالي 1.5 بوصة مربعة من ورق المسافة ، وقطع مثلثات صغيرة على كل وجه من وجه الساحة ، مع الشقوق في الزوايا للمساعدة في التفاف القطب.
إضافة خمس قطرات من محلول كلوريد البوتاسيوم 50٪ على الأخدود الأنود الفضي من القطب، وربط قطرات بحيث تشكل حلقة مستمرة من الحل. إضافة قطرتين من محلول كلوريد البوتاسيوم إلى الجزء العلوي من القطب البلاتين، ووضع بعناية ورقة المسافة على رأس القطب البلاتين، وتنعيم الورق حتى لا تكون هناك فقاعات الهواء. قطع ما يقرب من قطعة بوصة اثنين طويلة من S4 30M PTFE غشاء، ووضعها على رأس ورقة المسافة، وإزالة حواف الغشاء بحيث يتم محاذاتها مع الحلقة الخارجية من القطب.
باستخدام قضيب O-ring، ادفع حلقة O صغيرة فوق القطب لتأمين ورقة المسافة والغشاء على القطب، ووضع حلقة O أكبر على الأخدود الدائري للأقطاب الكهربائية، مع الحرص على عدم وجود غشاء تحته. حرك الغرفة العلوية من القطب على القاعدة ، والمسمار قطعتين معا. ضع القطب المجمع على قاعدته، وتوصيل القطب لنظام المراقبة.
لتحديد معدل التفاعل الأنزيمي، استخدم قطبًا كهربائيًا حساسًا للأكسجين من نوع Clark، مع تكامل الكمبيوتر لقياس استهلاك الأكسجين عبر وحدة التحكم في القطب الكهربائي. إضافة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت تريس في حجم المناسبة من الركيزة إلى غرفة القطب، واثارة الحل لمدة 10 ثانية. بعد 10 ثانية، ببطء ختم الغرفة مع المكبس، والمسمار من أعلى إلى أسفل.
استخدام الأنسجة النظيفة لامتصاص السائل الزائد الذي يتم إزاحته من الغرفة، والسماح للالكترود لتكدير حيث يمكن أن تنتج قياس مستقر لتركيز الأكسجين في الحل لمدة دقيقة واحدة على الأقل. بعد ذلك ، استخدم حقنة 10 ميكرولتر ضيقة بالغاز لإضافة ما يقرب من ميكرولتر من الإنزيم إلى غرفة القطب الكهربائي من خلال المكبس ، وجمع بيانات المعدل. عندما تم جمع كل من معدل لتركيز الركيزة معينة، واستخدام أنبوب من البلاستيك متصلة قارورة فراغ الذراع الجانبية لإفراغ غرفة القطب، وشطف مرارا وتكرارا الغرفة لمدة أربع إلى ست دورات بالماء.
ثم، إعداد الحل في القطب كما أظهرت للتو، وذلك باستخدام تركيز الركيزة الجديدة. تحليل هلام SDS-PAGE من الكسور الفردية من DesB-maltose ربط بروتين الانصهار بناء بناء يكشف عن عزلة من منتج البروتين النقي، جانبا لوجود DesB وmalose المنتجات مجال البروتين ملزمة التي تشقوق من بعضها البعض. مرة واحدة وقد اتخذت جميع القياسات الحركية، يمكن الحصول على نشاط DesB مع جالاتي، على سبيل المثال، عن طريق قياس معدل استهلاك الأكسجين في تركيزات غالات مختلفة.
وعلى العكس من ذلك، يمكن تحديد معدل تثبيط ديسب مع أربعة نيتروكاتكول من خلال مراقبة انخفاض في معدل استهلاك الأكسجين من ديسب مع غالات واحد ملليمولار في وجود تركيزات متفاوتة من أربعة نيتروكاتكول، مما يشير، على سبيل المثال، إلى أن أربعة نيترو كنتيكاتكول يمنع استهلاك الأكسجين وبالتالي رد فعل ديسب. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لدراسة إنزيمات الديوكسيجيناز المعتمدة على الحديد ، يمكن تطبيقه على أنظمة أخرى ، مثل metalloenzymes الأخرى. لا ننسى أن العمل داخل مربع القفازات يمكن أن يكون تحديا، لذلك الحرص على عدم التسرع أثناء تنفيذ هذه التقنية.
