Diese Methode wurde entwickelt, um wichtige Fragen im Bereich der anorganischen Biochemie zu beantworten, wie die Enzymaktivität in Proteinen, die sauerstoffempfindliche Metalle enthalten, aufrechterhalten werden kann. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie Ihnen hilft, Möglichkeiten zu visualisieren, wie Sie das Metall eines Proteins in seinem reduzierten Zustand erhalten können. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Technik sind, Schwierigkeiten haben, weil es schwierig ist, Materialien und Reagenzien zu erhalten, um vollständig anaerobe zu sein.
24 Stunden nach induzieren der Proteinexpression, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation, und setzen Sie das bakterielle Zellpellet in 20 Milliliter Amylose-Säulenpuffer pro 1,5 Liter Wachstum aus. Fügen Sie ein Milligramm Lysozym in die Zellsuspension und rühren Sie die Zellen für 20 Minuten auf Eis. Am Ende der Inkubation lysieren Sie die resuspendierte Zelllösung über Hochdruckhomogenisierung mit drei bis fünf Durchgängen bei ca. 15.000 psi und übertragen Sie das Protein in ein 50-Milliliter-Zentrifugenrohr.
Spülen Sie den Kopfraum für eine Minute mit Stickstoff, und zentrifugieren Sie die Zelle lysieren, um die unlöslichen Ablagerungen zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand auf mindestens ein 50-Milliliter-Rohr und kappen Sie das Lysat mit einem Gummiseptum. Mit einer 20-Spur-Nadel, langsam Blase Stickstoffgas durch die Lösung für zwei Minuten, um den Sauerstoff zu verdrängen.
Dann wickeln Sie das Septum mit Paraffinfolie, sichern Sie den Parafilm mit Kupferdraht und legen Sie den Überstand mit den Säulenmaterialien in den Handschuhkasten. Wenn sich das Lösungsmittel knapp über dem Harzbett befindet, in einer zuvor vorbereiteten Amylosesäule, 50 Milliliter Proteinüberstand auf die Säule laden und den Durchfluss in Fünf-Milliliter-Fraktionen unter mäßig unter Druck stehendem Stickstoff mit etwa fünf Millilitern pro Minute sammeln. Wenn der gesamte Durchfluss eluiert wurde, waschen Sie die Spalte mit einem weiteren dreispaltigen Volumen des Amylose-Spaltenpuffers.
Fügen Sie fünf CV Elutionspuffer hinzu und sammeln Sie dann manuell Drei-Milliliter-Fraktionen in Glas-Reagenzgläsern unter mäßig unter Druck stehendem Stickstoff. Testen Sie die Lösungen auf Sauerstoffpräsenz mit Eisenammoniumsulfat und Dithiothreitol. Die Lösung wird dunkelblau oder schwarz, wenn Sauerstoff vorhanden ist, wie das Rohr auf der rechten Seite.
Das Vorhandensein von Sauerstoff führt zu gereinigtem Protein mit geringer katalytischer Aktivität. Lösungen mit minimalem Sauerstoff vorhanden wird Lavendel oder hellblau transluzente Farbe sein, wie die Röhre auf der linken Seite. Als nächstes verwenden Sie eine externe Stickstoffleitung, um die gerührte Zellkammer unter Druck zu setzen, und konzentrieren Sie das Protein auf 50 Milliliter bei einer moderaten Rührgeschwindigkeit zweimal.
Anschließend das Protein auf 10 Milliliter konzentrieren und das konzentrierte Protein durch einen 0,45-Mikrometer-Porenspritzenfilter filtern. Aliquot 150 Mikroliter Protein in einzelne 200-Mikroliter Polymerase-Kettenreaktionsröhren. Dann entfernen Sie die gekappten Aliquots aus dem Handschuhkasten für sofortiges Einfrieren in flüssigem Stickstoff und Lagerung bei minus 80 Grad Celsius.
Für DesB-Entsalzung zunächst drei Milliliter Sephadex G-25 Grobentsalzungsgel zu einer Neun-Milliliter-Borosilikatsäule hinzufügen und die Säule mit zwei Säulenvolumen entgastem Entsalzungspuffer waschen. Wenn der DesB aufgetaut ist, laden Sie das gereinigte Protein über einen schwerkraftgesteuerten Prozess auf die Säule und entsorgen Sie den Durchfluss, bevor Sie drei Tropfen Protein in jeden der 12 Durchstechflaschen mit etwa fünf Millilitern Entsalzungspuffer elutieren. Um die Sauerstoffelektrode vorzubereiten, verwenden Sie eine Schere, um ein etwa 1,5-Zoll-Quadrat von Spacer-Papier zu schneiden, und schneiden Sie kleine Dreiecke auf jede Fläche des Quadrats, mit Schlitzen in den Ecken, um bei der Umhüllung der Elektrode zu helfen.
Fügen Sie fünf Tropfen einer 50%Kaliumchlorid-Lösung auf die silberne Anodennut der Elektrode und verbinden Sie die Tropfen, so dass sie einen kontinuierlichen Ring der Lösung bilden. Fügen Sie zwei Tropfen der Kaliumchloridlösung an die Oberseite der Platinelektrode und legen Sie das Abstandspapier vorsichtig auf die Platinelektrode, wodurch das Abstandspapier geglättet wird, sodass keine Luftblasen entstehen. Schneiden Sie ein etwa zwei Zoll langes Stück S4 30m PTFE-Membran, und legen Sie es auf das Abstandspapier, wodurch die Ränder der Membran entfernt werden, sodass sie am äußeren Ring der Elektrode ausgerichtet sind.
Mit einem O-Ring-Applikator einen kleinen O-Ring über die Elektrode schieben, um das Abstandspapier und die Membran auf die Elektrode zu befestigen, und legen Sie einen größeren O-Ring auf die kreisförmige Nut der Elektrode, wobei darauf zu achten ist, dass sich keine Membran darunter befindet. Schieben Sie die obere Kammer der Elektrode auf die Basis und schrauben Sie die beiden Teile zusammen. Legen Sie die montierte Elektrode auf ihre Basis und schließen Sie die Elektrode an das Überwachungssystem an.
Um die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion zu bestimmen, verwenden Sie eine sauerstoffempfindliche Clark-Elektrode mit Computerintegration, um den Sauerstoffverbrauch über die Elektrodensteuereinheit zu messen. Fügen Sie einen Milliliter Tris-Puffer in das entsprechende Substratvolumen in die Elektrodenkammer und rühren Sie die Lösung 10 Sekunden lang. Nach 10 Sekunden die Kammer langsam mit dem Kolben versiegeln und die Oberseite nach unten schrauben.
Verwenden Sie ein sauberes Gewebe, um die überschüssige Flüssigkeit, die aus der Kammer verdrängt wird, aufzusaugen, und lassen Sie die Elektrode auslagern, wo sie eine stabile Messung der Sauerstoffkonzentration in der Lösung für mindestens eine Minute erzeugen kann. Als nächstes verwenden Sie eine gasdichte 10-Mikroliter-Spritze, um etwa einen Mikroliter Enzym durch den Kolben in die Elektrodenkammer zu geben, und sammeln Sie die Ratedaten. Wenn die gesamte Rate für eine gegebene Substratkonzentration gesammelt wurde, verwenden Sie ein Kunststoffrohr, das mit einem Seitenarm-Vakuumkolben verbunden ist, um die Elektrodenkammer zu entleeren, und spülen Sie die Kammer wiederholt für vier bis sechs Zyklen mit Wasser.
Richten Sie dann die Lösung in der Elektrode ein, wie gerade gezeigt, mit einer neuen Substratkonzentration. Die SDS-PAGE-Gelanalyse einzelner Fraktionen aus der DesB-Maltose-Bindungsprotein-Fusionslösung zeigt die Isolierung eines reinen Proteinprodukts, abgesehen vom Vorhandensein von VonB- und Maltose-bindenden Protein-Domänenprodukten, die voneinander abgenommen sind. Sobald alle kinetischen Messungen durchgeführt wurden, kann die Aktivität von DesB mit Galat beispielsweise durch Messung der Sauerstoffverbrauchsrate in unterschiedlichen Gallatkonzentrationen erreicht werden.
Umgekehrt kann die Hemmungsrate von DesB mit Vier-Nitrocatechol bestimmt werden, indem die Reduktion der Sauerstoffverbrauchsrate von DesB mit einmillimolarem Gallat in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von Vier-Nitrocatechol beobachtet wird, was beispielsweise darauf hindeutet, dass Vier-Nitrocatechol den Sauerstoffverbrauch und damit die DesB-Reaktion hemmt. Obwohl diese Methode Einen Einblick in die Untersuchung von eisenabhängigen Dioxygenase-Enzymen liefern kann, kann sie auf andere Systeme, wie z. B. andere Metalloenzyme, angewendet werden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit in einem Handschuh-Box schwierig sein kann, so achten Sie darauf, nicht zu überstürzen, während der Durchführung dieser Technik.
