氧电极对 DesB 酶活性和抑制作用的厌氧蛋白纯化及动力学分析

该方法旨在回答无机生物化学领域中有关如何保持含有氧敏感金属的蛋白质中的酶活性的关键问题。这种技术的主要优点是，它可以帮助你可视化的方式，你可以保持蛋白质的金属在其减少状态。一般来说，这种技术的新个体将挣扎，因为很难保持材料和试剂是完全厌氧的。

诱导蛋白质表达24小时后，通过离心收集细胞，每1.5升生长20毫升的阿米洛塞柱缓冲液中重新填充细菌细胞颗粒。在细胞悬浮液中加入一毫克的酶，在冰上搅拌细胞20分钟。在孵育结束时，通过高压均质化将重新暂停的细胞溶液以大约15，000 psi的三到五次通过，将蛋白质转移到50毫升的离心管中。

用氮气冲洗头部空间一分钟，并离心细胞溶化，以去除不溶性碎屑。将上一液转移到至少一个 50 毫升的管中，用橡胶隔膜盖住酸盐。使用 20 量针，缓慢地将氮气冒泡通过溶液两分钟，以取代氧气。

然后，用石蜡膜包裹隔膜，用铜线固定 Parafilm，然后用柱材料将上看板放入手套箱中。当溶剂就在树脂床上方时，在先前准备的 amylose 柱中，将 50 毫升的蛋白质上清液加载到柱上，以大约 5 毫升/分钟的速度在中等加压氮下以 5 毫升的馏分收集流经。当所有流流已洗净后，用另外三列卷的 amylose 列缓冲区清洗列。

加入五 CV 的洗脱缓冲液，然后在中等加压氮气下在玻璃试管中手动收集三毫升馏分。使用硫酸铁铵和二硫醇测试氧存在溶液。如果存在氧气，溶液将变成深蓝色或黑色，就像右侧的管子一样。

氧气的存在会导致纯化蛋白的低催化活性。含氧量最小的溶液为薰衣草或浅蓝色半透明颜色，如左侧的管子。接下来，使用外部氮线对搅拌细胞室加压，以中等搅拌速度将蛋白质浓缩到50毫升两次。

然后，将蛋白质浓缩到10毫升，并通过0.45微米孔注射器过滤器过滤浓缩蛋白质。将150微升蛋白质放入单个200微升聚合酶链反应管。然后，从手套箱中取下封盖的等分，立即在液氮中闪冻，并在零下 80 摄氏度处储存。

对于 DesB 脱盐，首先将 Sephadex G-25 粗脱盐凝胶的三毫升添加到 9 毫升的硅酸盐柱中，然后用两列脱盐缓冲液洗涤柱。当DesB解冻后，通过重力控制过程将纯化的蛋白质加载到柱子上，然后丢弃流经，然后将三滴蛋白质放入12瓶中，并含有大约5毫升脱盐缓冲液。要准备氧电极，请使用剪刀切割一张约 1.5 英寸方的张子纸，并在正方形的每个面上切割小三角形，并在角上用缝隙帮助包装电极。

将五滴 50% 氯化钾溶液添加到电极的银阳极槽上，并将滴连接，使它们形成连续的溶液环。将两滴氯化钾溶液加入铂电极顶部，小心地将张膜放在铂电极顶部，使张气纸平滑，使无气泡。切割一块大约两英寸长的 S4 30m PTFE 膜，并放在张子纸上，去除膜的边缘，以便它们与电极的外圈对齐。

使用 O 形环施用器，将小 O 形环推过电极，将空间纸和膜固定到电极上，然后将较大的 O 形环放在电极的圆形凹槽上，注意下方没有膜。将电极的顶部腔室滑到底座上，将两块拧在一起。将组装的电极放在其底座上，然后将电极连接到监控系统。

要确定酶反应速率，请使用对氧敏感的克拉克型电极，通过计算机集成以测量通过电极控制单元的耗氧量。将适当体积的三叶光缓冲液加入电极腔，搅拌溶液10秒钟。10 秒后，用柱塞慢慢密封腔室，然后上下拧紧。

使用干净的组织吸收从腔室中置换的多余的液体，并允许电极平衡，在那里它可以产生溶液中氧气浓度的稳定测量至少一分钟。接下来，使用气密的10微升注射器，通过柱塞向电极室添加大约一微升的酶，并收集速率数据。收集给定基板浓度的所有速率后，使用连接到侧臂真空瓶的塑料管清空电极室，并用水反复冲洗腔室四到六次循环。

然后，使用新的基板浓度，在电极中设置溶液， 正如刚刚演示的。SDS-PAGE凝胶分析来自DesB-麦芽糖结合蛋白融合结构纯化的单个分数揭示了纯蛋白质产品的分离，除了 DesB 和麦芽糖结合蛋白域产品相互切割的存在。一旦所有动力学测量都完成，例如，可以通过测量不同胆汁浓度的耗氧率来获得具有胆汁的DesB活性。

相反，在存在不同浓度的四硝基二醇的情况下，通过观察四硝基二醇的一毫摩尔的德百的氧消耗率降低，可以确定四硝基二醇的抑制率，例如，表明四硝基二醇抑制氧气的消耗，从而抑制了 DesB 的反应。虽然这种方法可以为研究铁依赖性二氧酶提供见解，但它可以应用于其他系统，如其他金属糖酶。不要忘记在手套箱内工作可能具有挑战性，因此在执行此技术时注意不要着急。