Este método está diseñado para responder preguntas clave en la bioquímica inorgánica de campo, sobre cómo mantener la actividad enzimática en proteínas que contienen metales sensibles al oxígeno. La principal ventaja de esta técnica es que te ayuda a visualizar formas en las que puedes mantener el metal de una proteína en su estado reducido. Generalmente, los individuos nuevos en esta técnica lucharán porque es difícil mantener materiales y reactivos para ser completamente anaeróbicos.
24 horas después de inducir la expresión de proteínas, recoger las células por centrifugación, y resuspender el pellet celular bacteriano en 20 mililitros de tampón de columna de amilosa por 1,5 litros de crecimiento. Agregue un miligramo de suavezima a la suspensión celular y revuelva las células durante 20 minutos sobre hielo. Al final de la incubación, anlice la solución celular resuspendida mediante homogeneización de alta presión con tres a cinco pasadas a aproximadamente 15.000 psi, y transfiera la proteína a un tubo centrífugo de 50 mililitros.
Enjuague el espacio de la cabeza con nitrógeno durante un minuto y centrifugar el izado de la célula para eliminar los escombros insolubles. Transfiera el sobrenadante a al menos un tubo de 50 mililitros, y tape el izado con un tabique de goma. Usando una aguja de calibre 20, burbujee lentamente el gas nitrógeno a través de la solución durante dos minutos para desplazar el oxígeno.
Luego, envuelva el tabique con película de parafina, asegure el Parafilm con alambre de cobre y coloque el sobrenadante en la guantera con los materiales de la columna. Cuando el disolvente esté justo encima del lecho de resina, en una columna de amilosa previamente preparada, cargue 50 mililitros de sobrenadantes proteicos en la columna, recogiendo el flujo a través en fracciones de cinco mililitros bajo nitrógeno moderadamente presurizado a aproximadamente cinco mililitros por minuto. Cuando se haya eluido todo el flujo, lave la columna con otros tres volúmenes de columna de búfer de columna de amilosa.
Agregue cinco CV de tampón de elución y luego recoja manualmente fracciones de tres mililitros en tubos de ensayo de vidrio bajo nitrógeno moderadamente presurizado. Pruebe las soluciones para la presencia de oxígeno con sulfato de amonio ferroso y ditiothreitol. La solución se volverá azul oscuro o negro si hay oxígeno, como el tubo de la derecha.
La presencia de oxígeno dará lugar a proteína purificada con baja actividad catalítica. Las soluciones con oxígeno mínimo presente serán de color lavanda o azul claro translúcido, como el tubo de la izquierda. A continuación, utilice una línea de nitrógeno externa para presurizar la cámara celular agitada y concentre la proteína a 50 mililitros a una velocidad de agitación moderada dos veces.
Luego, concentre la proteína en 10 mililitros y filtre la proteína concentrada a través de un filtro de jeringa de 0,45 micrómetros poros. Aliquot 150 microlitros de proteína en tubos individuales de reacción en cadena de 200 microlitros polimerasa. A continuación, retire las alícuotas tapadas de la guantera para la congelación inmediata del flash en nitrógeno líquido y su almacenamiento a menos 80 grados centígrados.
Para desalar DesB, primero agregue tres mililitros de Gel de desalado grueso Sephadex G-25 a una columna de borosilicato de nueve mililitros, y lave la columna con dos volúmenes de columna de tampón de desalado desgastado. Cuando el DesB se haya descongelado, cargue la proteína purificada en la columna a través de un proceso controlado por gravedad y deseche el flujo antes de eluir tres gotas de proteína en cada uno de los 12 viales, con aproximadamente cinco mililitros de tampón de desalado. Para preparar el electrodo de oxígeno, utilice tijeras para cortar una aproximadamente 1,5 pulgadas cuadradas de papel espaciador, y corte pequeños triángulos en cada cara del cuadrado, con aberturas en las esquinas para ayudar en el envoltorio del electrodo.
Agregue cinco gotas de una solución de cloruro de potasio al 50% en la ranura de ánodo de plata del electrodo, y conecte las gotas para que formen un anillo continuo de solución. Agregue dos gotas de la solución de cloruro de potasio a la parte superior del electrodo de platino, y coloque cuidadosamente el papel espaciador en la parte superior del electrodo de platino, suavizando el papel espaciador para que no haya burbujas de aire. Corte una pieza de aproximadamente dos pulgadas de largo de membrana de PTFE S4 de 30 m, y colóquela en la parte superior del papel espaciador, eliminando los bordes de la membrana para que estén alineados con el anillo exterior del electrodo.
Usando un aplicador de junta tórica, empuje una pequeña junta tórica sobre el electrodo para fijar el papel espaciador y la membrana en el electrodo, y coloque una junta tórica más grande en la ranura circular del electrodo, teniendo cuidado de que no haya membrana debajo. Deslice la cámara superior del electrodo sobre la base y atornille las dos piezas juntas. Coloque el electrodo montado en su base y conecte el electrodo al sistema de monitoreo.
Para determinar la tasa de reacción enzimática, utilice un electrodo de tipo Clark sensible al oxígeno, con integración por computadora para medir el consumo de oxígeno a través de la unidad de control de electrodos. Agregue un mililitro de tampón Tris en el volumen adecuado de sustrato a la cámara del electrodo y revuelva la solución durante 10 segundos. Después de 10 segundos, selle lentamente la cámara con el émbolo y atornille la parte superior hacia abajo.
Utilice un tejido limpio para absorber el exceso de líquido que se desplaza de la cámara, y permita que el electrodo se equilibre donde puede producir una medición estable de la concentración de oxígeno en la solución durante al menos un minuto. A continuación, utilice una jeringa de 10 microlitros hermética al gas para agregar aproximadamente un microlitro de enzima a la cámara del electrodo a través del émbolo y recopile los datos de velocidad. Cuando se haya recogido toda la velocidad para una concentración de sustrato determinada, utilice un tubo de plástico conectado a un matraz de vacío de brazo lateral para vaciar la cámara del electrodo, y enjuague repetidamente la cámara durante cuatro a seis ciclos con agua.
A continuación, configure la solución en el electrodo como se acaba de demostrar, utilizando una nueva concentración de sustrato. El análisis de gel SDS-PAGE de fracciones individuales de la purificación de la construcción de la fusión de proteínas de unión a DesB-maltosa revela el aislamiento de un producto proteico puro, aparte de la presencia de productos de dominio proteico de unión a DesB y maltosa que se separaron entre sí. Una vez tomadas todas las mediciones cinéticas, la actividad de DesB con gallato, por ejemplo, se puede obtener midiendo la tasa de consumo de oxígeno en diferentes concentraciones de gallato.
Por el contrario, la tasa de inhibición de DesB con cuatro-nitrocatechol se puede determinar observando la reducción de la tasa de consumo de oxígeno de DesB con un galario de unlilolar en presencia de concentraciones variables de cuatro-nitrocatechol, lo que indica, por ejemplo, que el cuatro-nitrocatechol inhibe el consumo de oxígeno y, por lo tanto, la reacción DesB. Aunque este método puede proporcionar información al estudio de las enzimas dioxigenasas dependientes de ferros, se puede aplicar a otros sistemas, como otras metaloenzimas. No olvides que trabajar dentro de una guantera puede ser un reto, así que ten cuidado de no apresurarte mientras realizas esta técnica.
