Этот метод предназначен для ответа на ключевые вопросы в области неорганической биохимии, о том, как поддерживать активность ферментов в белках, содержащих чувствительные к кислороду металлы. Основным преимуществом этой техники является то, что она помогает визуализировать способы, в которых вы можете поддерживать металл белка в его уменьшенном состоянии. Как правило, лица, новые для этой техники будет бороться, потому что трудно поддерживать материалы и реагенты, чтобы быть полностью анаэробным.
Через 24 часа после индуцирования экспрессии белка, собирать клетки центрифугации, и повторно бактериальных клеток гранулы в 20 миллилитров буфера амилозы колонки на 1,5 литра роста. Добавьте один миллиграмм лизозима в подвесную клетку и перемешайте клетки в течение 20 минут на льду. В конце инкубации, лизировать повторного раствора клеток через высокое давление гомогенизации с трех до пяти проходов примерно на 15000 пси, и передать белок в 50-миллилитровый центрифуги трубки.
Промыть головное пространство азотом в течение одной минуты, и центрифуга клетки лисировать, чтобы удалить нерастворимый мусор. Перенесите супернатант как минимум на одну 50-миллилитровую трубку и завялите лизат резиновой перегородкой. Используя 20-го калибра иглы, медленно пузырь азота газа через раствор в течение двух минут, чтобы вытеснить кислорода.
Затем оберните перегородку парафиновой пленкой, закрелите Парафильм медной проволокой и поместите супернатант в перчаточный ящик с материалами колонки. Когда растворитель находится чуть выше кровати смолы, в ранее подготовленной колонке амилоса, загрузите 50 миллилитров белкового супернатанта на колонку, собирая поток через пятими миллилитровые фракции под умеренно под давлением азота примерно в пять миллилитров в минуту. Когда весь поток-через был eluted, мыть столбец с еще тремя объемами столбца буфера амилой столбца.
Добавьте пять резюме буфера элюции, а затем вручную соберите трехми миллилитровые фракции в стеклянных пробирках под азотом умеренного давления. Проверьте растворы присутствия кислорода с сульфатом аммония и дитиотрейтолом. Раствор станет темно-синим или черным, если кислород присутствует, как трубка справа.
Наличие кислорода приведет к очищению белка с низкой каталитической активностью. Решения с минимальным кислородом настоящее время будет лаванды или светло-голубой полупрозрачный цвет, как трубка слева. Затем используйте внешнюю линию азота для давления перемешиваемой клеточной камеры и концентрируйте белок до 50 миллилитров при умеренной скорости перемешивания в два раза.
Затем сконцентрировать белок до 10 миллилитров и отфильтровать концентрированный белок через фильтр шприца 0,45 микрометра. Aliquot 150 микролитров белка в отдельных 200-микролитера полимеразы цепной реакции труб. Затем удалите ограниченные алициты из бардачка для немедленного флэш-замораживания в жидком азоте и хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Для desB опреснительного, сначала добавьте три миллилитров Sephadex G-25 Грубый десалирование геля в девятими миллилитровый боросиликат колонки, и мыть колонку с двумя объемами столбца дегазации дегазации буфера. Когда DesB разморозится, загрузите очищенный белок на колонку через процесс, контролируемый гравитацией, и отбросьте поток через три капли белка в каждый из 12 флаконов, с приблизительно пятью миллилитров буфера опреснивания. Чтобы подготовить кислородный электрод, используйте ножницы, чтобы сократить один примерно 1,5-дюймовый квадрат бумаги спейсера, и вырезать небольшие треугольники на каждой стороне площади, с прорезями в углах, чтобы помочь в упаковке электрода.
Добавьте пять капель раствора хлорида калия на серебряную анодную канавку электрода и соедините капли таким образом, чтобы они образуют непрерывное кольцо раствора. Добавьте две капли раствора хлорида калия в верхнюю часть платинового электрода и аккуратно поместите бумагу-пространство поверх платинового электрода, разглаживает бумагу-пространство, чтобы не было пузырьков воздуха. Вырезать примерно два дюйма длиной кусок мембраны S4 30m PTFE, и поместите его на верхней части бумаги спейсера, удаляя края мембраны, чтобы они выровнены с внешним кольцом электрода.
Используя Аппликатор O-кольца, нажмите небольшой O-кольцо над электродом, чтобы обеспечить бумагу и мембрану на электроде, и поместите больший O-кольцо на круговой паз электрода, заботясь о том, чтобы под ним не было мембраны. Сдвиньте верхнюю камеру электрода на основание и свиньте две части вместе. Поместите собранный электрод на его основание и соедините электрод с системой мониторинга.
Чтобы определить скорость энзиматической реакции, используйте чувствительный к кислороду электрод типа Clark, с компьютерной интеграцией для измерения потребления кислорода через блок управления электродом. Добавьте один миллилитр буфера Tris в соответствующем объеме субстрата в электродную камеру и перемешайте раствор в течение 10 секунд. Через 10 секунд, медленно запечатать камеру с поршень, и винт сверху вниз.
Используйте чистую ткань, чтобы впитать избыток жидкости, которая вытесняется из камеры, и позволить электроду уравнять, где он может производить стабильное измерение концентрации кислорода в растворе, по крайней мере одну минуту. Затем используйте газопритяжный 10-микролитровый шприц, чтобы добавить примерно один микролитер фермента в электродную камеру через поршень и собрать данные о скорости. Когда вся скорость для данной концентрации субстрата была собрана, используйте пластиковую трубку, подключенную к боковой руке вакуумной колбы, чтобы очистить электродную камеру, и неоднократно промыть камеру в течение четырех-шести циклов с водой.
Затем установите раствор в электроде, как только что продемонстрировано, используя новую концентрацию субстрата. SDS-PAGE гель анализ отдельных фракций из DesB-мальтозы связывания белка синтеза конструкции очистки показывает изоляцию чистого белкового продукта, в стороне от наличия DesB и мальтозы связывания белковых продуктов домена, которые расщепляются друг от друга. После того, как все кинетические измерения были приняты, активность DesB с галлатом, например, может быть получена путем измерения скорости потребления кислорода в различных концентрациях галлата.
И наоборот, скорость ингибирования DesB с четырьмя нитрокатехолами может быть определена путем наблюдения за снижением скорости потребления кислорода DesB с одномимимола галлатом при наличии различных концентраций четырехтрокатехола, что указывает, например, на то, что четырехнитокатехол подавляет потребление кислорода и тем самым реакцию DesB. Хотя этот метод может дать представление об изучении феррос-зависимых ферментов диоксигеназы, он может быть применен к другим системам, таким как другие металлоэнзимы. Не забывайте, что работа в бардачке может быть сложной задачей, так что позаботьтесь, чтобы не спешить при выполнении этой техники.
