この方法は、無機生化学分野の重要な質問に答えるように設計されています, 酸素感受性金属を含むタンパク質の酵素活性を維持する方法について.この手法の主な利点は、タンパク質の金属を還元状態に維持する方法を視覚化できることです。一般的に、この技術に新しい個人は、完全に嫌気性であるため、材料や試薬を維持することが困難であるため、苦労します。
タンパク質発現を誘導してから24時間後、遠心分離により細胞を回収し、増殖1.5リットル当たり20ミリリットルのアミロースカラムバッファーで細菌細胞ペレットを再懸濁する。細胞懸濁液にリソザイムを1ミリグラム加え、氷の上で20分間かき混ぜる。インキュベーションの終わりに、約15,000 psiで3〜5回のパスで高圧均質化を介して再懸濁細胞溶液を溶解し、タンパク質を50ミリリットルの遠心分離管に移します。
ヘッドスペースを窒素で1分間洗い流し、細胞溶解物を遠心分離して不溶性の破片を取り除きます。上清を少なくとも1本の50ミリリットルチューブに移し、ラバー中隔でリゼートをキャップする。20ゲージの針を使用して、溶液を通してゆっくりと窒素ガスを2分間泡立て、酸素を変位させます。
その後、中隔をパラフィンフィルムで包み、パラフィルムを銅線で固定し、上澄み物をカラム材料でグローブボックスに入れます。溶媒が樹脂床のすぐ上にある場合、以前に調製したアミロースカラムに、50ミリリットルのタンパク質上清をカラムに負荷し、適度に加圧された窒素の下で5ミリリットルの分量でフロースルーを1分あたり約5ミリリットルで回収する。すべてのフロースルーが溶出したら、アミロースカラムバッファの別の3カラムボリュームでカラムを洗います。
溶出バッファーの 5 つの CV を追加し、手動で適度に加圧窒素の下ガラス試験管に 3 ミリリットル分分を収集します。.硫酸第一鉄アンモニウムとジチオトレイトールを用いて酸素存在の溶液をテストします。溶液は、右側のチューブのように、酸素が存在する場合は濃い青色または黒に変わります。
酸素の存在は、低触媒活性を有する精製タンパク質をもたらす。酸素が少ない溶液は、ラベンダーまたは水色の半透明色、左側のチューブのように。次に、外部窒素ラインを用いて撹拌細胞チャンバーを加圧し、適度な攪拌速度でタンパク質を50ミリリットルに濃縮する。
その後、タンパク質を10ミリリットルに濃縮し、0.45マイクロメートルの細孔注射器フィルターを介して濃縮タンパク質を濾過する。アリコート150マイクロリットルのタンパク質を個々の200マイクロリットルのポリメラーゼ連鎖反応チューブに。その後、グローブボックスからキャップされたアリコートを取り出し、液体窒素で即時のフラッシュ凍結を行い、マイナス80°Cで貯蔵します。
DesB脱塩の場合は、まずセファデックスG-25粗塩脱塩ゲルの3ミリリットルを9ミリリットルのホウケイ酸カラムに加え、2列の脱塩脱塩緩衝液でカラムを洗浄します。DesBが解凍したら、精製したタンパク質を重力制御プロセスを介してカラムにロードし、フロースルーを破棄してから、3滴のタンパク質を12個のバイアルのそれぞれに溶出させ、約5ミリリットルの脱塩バッファーを使用します。酸素電極を準備するには、はさみを使用して約1.5インチの正方形のスペーサーペーパーをカットし、正方形の各面に小さな三角形をカットし、角にスリットを入れ、電極のラッピングを支援します。
50%塩化カリウム溶液を電極の銀アノード溝に5滴加え、溶液の連続リングを形成するように滴を接続します。塩化カリウム溶液を白金電極の上部に2滴加え、白金電極の上にスペーサーペーパーを慎重に置き、空き紙を滑らかにし、気泡がないようにスペーサーペーパーを滑らかにします。約2インチの長さのS4 30m PTFE膜を切り、スペーサーペーパーの上に置き、膜の端を取り除き、電極の外輪に合わせるようにします。
Oリングアプリケータを使用して、小さなOリングを電極の上に押し込んでスペーサーの紙と膜を電極に固定し、電極の円形溝に大きなOリングを置き、下に膜が存在しないのに注意します。電極の上部チャンバーをベースにスライドさせ、2つの部分を一緒にねじ込みます。組み立てた電極をベースに置き、電極を監視システムに接続します。
酵素反応の速度を決定するには、酸素感受性クラーク型電極を使用し、コンピュータインテグレーションを使用して、電極制御ユニットを介して酸素消費量を測定します。電極室に適切な基板の量にトリスバッファーの1ミリリットルを追加し、10秒間溶液をかき混ぜます。10秒後、チャンバーをプランジャーでゆっくりと密封し、上部を下にねじ込みます。
クリーンな組織を使用してチャンバーから変位した余分な液体を吸収し、電極が溶液中の酸素濃度を少なくとも1分間安定して測定できる平衡化を可能にする。次に、気密性のある10マイクロリットルのシリンジを使用して、プランジャーを通して約1マイクロリットルの酵素を電極チャンバーに加え、レートデータを収集します。所定の基板濃度の全レートが収集された場合は、サイドアーム真空フラスコに接続されたプラスチックチューブを使用して電極室を空にし、チャンバーを4~6サイクル水で繰り返しリンスします。
次いで、新しい基板濃度を用いて、ちょうど実証したように電極に溶液をセットアップする。DesB-maltose結合タンパク質融合構築物の精製からの個々の画分のSDS-PAGEゲル分析は、DesBおよびマルトース結合タンパク質ドメイン産物が互いに切断される産物の存在を除いて、純粋なタンパク質産物の単離を明らかにする。すべての運動測定が行われたら、ガレートを用いたDesBの活性は、例えば、様々なガレート濃度における酸素消費速度を測定することによって得ることができる。
逆に、4-ニトロカテコールによるDesBの阻害率は、4-ニトロカテコールの様々な濃度の存在下で1ミリモルガレートでDesBの酸素消費率の低下を観察することによって決定することができ、例えば、4-ニトロカテコールは酸素の消費を阻害し、それによってDesB反応を阻害することを示す。この方法は、鉄依存性ジオキシゲナーゼ酵素の研究に関する洞察を提供することができますが、他の金属酵素などの他のシステムにも適用できます。グローブボックス内での作業は難しい場合があるので、このテクニックを実行しながら急がないように注意してください。
