Cette méthode est conçue pour répondre aux questions clés dans le domaine de la biochimie inorganique, sur la façon de maintenir l’activité enzymatique dans les protéines qui contiennent des métaux sensibles à l’oxygène. Le principal avantage de cette technique est qu’elle vous aide à visualiser les façons dont vous pouvez maintenir le métal d’une protéine dans son état réduit. En général, les personnes nouvelles à cette technique auront du mal parce qu’il est difficile d’entretenir les matériaux et les réagéteurs pour être complètement anaérobie.
24 heures après avoir induisant l’expression de protéine, recueillez les cellules par centrifugation, et résuspendez la pastille bactérienne de cellules dans 20 millilitres de tampon de colonne d’amylose par 1.5 litres de croissance. Ajouter un milligramme de lysozyme à la suspension cellulaire et remuer les cellules pendant 20 minutes sur la glace. À la fin de l’incubation, lyse la solution cellulaire résuspendue par homogénéisation à haute pression avec trois à cinq passages à environ 15 000 psi, et transférer la protéine dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres.
Rincer l’espace libre avec de l’azote pendant une minute, et centrifuger la cellule lysate pour enlever les débris insolubles. Transférer le supernatant sur au moins un tube de 50 millilitres et capuchonner le lysate à l’aide d’un septum en caoutchouc. À l’aide d’une aiguille de calibre 20, bullez lentement le gaz azoté à travers la solution pendant deux minutes pour déplacer l’oxygène.
Ensuite, enveloppez le septum avec du film de paraffine, fixez le parafilm avec du fil de cuivre et placez le supernatant dans la boîte à gants avec les matériaux de la colonne. Lorsque le solvant se trouve juste au-dessus du lit en résine, dans une colonne d’amylose préparée précédemment, chargez 50 millilitres de protéines supernatant sur la colonne, recueillant le débit en fractions de cinq millilitres sous azote modérément pressurisé à environ cinq millilitres par minute. Lorsque tout le flux a été élucidé, lavez la colonne avec trois autres volumes de colonne de tampon de colonne d’amylose.
Ajouter cinq CV de tampon d’élitution, puis collecter manuellement des fractions de trois millilitres dans des tubes à essai en verre sous azote modérément pressurisé. Testez les solutions pour la présence d’oxygène avec du sulfate d’ammonium ferreux et du dithiothreitol. La solution deviendra bleu foncé ou noir si l’oxygène est présent, comme le tube sur la droite.
La présence d’oxygène se traduira par une protéine purifiée à faible activité catalytique. Les solutions avec un minimum d’oxygène présent seront la lavande ou bleu clair couleur translucide, comme le tube sur la gauche. Ensuite, utilisez une ligne d’azote externe pour pressuriser la chambre cellulaire agitée et concentrez la protéine à 50 millilitres à une vitesse d’agitation modérée à deux reprises.
Ensuite, concentrez la protéine à 10 millilitres et filtrez la protéine concentrée à l’aide d’un filtre à seringues de 0,45 micromètre-pore. Aliquot 150 microlitres de protéines en tubes individuels de réaction en chaîne de polymése de 200 microlitres. Ensuite, retirez les aliquots plafonnés de la boîte à gants pour obtenir un gel immédiat par flash dans l’azote liquide et le stockage à moins 80 degrés Celsius.
Pour le desalting DesB, ajoutez d’abord trois millilitres de gel de desalage grossier Sephadex G-25 à une colonne de borosilicate de neuf millilitres, et lavez la colonne avec deux volumes de colonne de tampon de desalte dégazé. Lorsque le DesB a décongelé, chargez la protéine purifiée sur la colonne au moyen d’un processus contrôlé par gravité et jetez le débit avant d’écouler trois gouttes de protéines dans chacun des 12 flacons, avec environ cinq millilitres de tampon de desalage. Pour préparer l’électrode d’oxygène, utilisez des ciseaux pour couper un environ 1,5 pouce carré de papier espaceur, et couper de petits triangles sur chaque face du carré, avec des fentes dans les coins pour faciliter l’emballage de l’électrode.
Ajouter cinq gouttes d’une solution de chlorure de potassium à 50% sur la rainure d’anode argentée de l’électrode, et connecter les gouttes afin qu’elles forment un anneau continu de solution. Ajouter deux gouttes de la solution de chlorure de potassium au sommet de l’électrode de platine, et placer soigneusement le papier espaceur sur le dessus de l’électrode de platine, lissant le papier de l’espaceur de sorte qu’il n’y ait pas de bulles d’air. Coupez un morceau d’environ deux pouces de long de la membrane PTFE S4 de 30 m, et placez-le sur le papier de l’espaceur, en enlevant les bords de la membrane afin qu’ils soient alignés avec l’anneau externe de l’électrode.
À l’aide d’un applicateur o-ring, poussez un petit anneau O sur l’électrode pour fixer le papier et la membrane de l’espaceur sur l’électrode, et placez un plus grand anneau O sur la rainure circulaire de l’électrode, en prenant soin qu’il n’y ait pas de membrane en dessous. Faites glisser la chambre supérieure de l’électrode sur la base et vissez les deux morceaux ensemble. Placez l’électrode assemblée sur sa base et connectez l’électrode au système de surveillance.
Pour déterminer le taux de réaction enzymatique, utilisez une électrode de type Clark sensible à l’oxygène, avec intégration informatique pour mesurer la consommation d’oxygène via l’unité de contrôle des électrodes. Ajouter un millilitre de tampon Tris dans le volume approprié de substrat à la chambre d’électrode, et remuer la solution pendant 10 secondes. Après 10 secondes, sceller lentement la chambre avec le piston, et visser le haut vers le bas.
Utilisez un tissu propre pour absorber l’excès de liquide qui est déplacé de la chambre, et permettre à l’électrode d’équilibrer où elle peut produire une mesure stable de la concentration d’oxygène dans la solution pendant au moins une minute. Ensuite, utilisez une seringue étanche au gaz de 10 microlitres pour ajouter environ un microlitre d’enzyme à la chambre d’électrode à travers le piston, et recueillir les données de taux. Lorsque toute la concentration d’un substrat donné a été recueillie, utilisez un tube en plastique relié à un flacon sous vide latéral pour vider la chambre d’électrode et rincez la chambre à plusieurs reprises pendant quatre à six cycles avec de l’eau.
Ensuite, installez la solution dans l’électrode comme il vient de le démontrer, en utilisant une nouvelle concentration de substrat. L’analyse du gel SDS-PAGE des fractions individuelles de la purification de la construction de fusion protéique liant DesB-maltose révèle l’isolement d’un produit protéique pur, mis à part la présence de produits de domaine protéiques liants DesB et maltose qui se fendaient les uns des autres. Une fois que toutes les mesures cinétiques ont été prises, l’activité de DesB avec gallate, par exemple, peut être obtenue en mesurant le taux de consommation d’oxygène dans différentes concentrations de gallate.
Inversement, le taux d’inhibition de DesB avec quatre nitrocatechol peut être déterminé en observant la réduction du taux de consommation d’oxygène de DesB avec gallate d’un millimolaire en présence de concentrations variables de quatre nitrocatechol, indiquant, par exemple, que le quatre-nitrocatechol inhibe la consommation d’oxygène et donc la réaction des DesB. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’étude des enzymes de dioxygénase ferreux-dépendantes, elle peut être appliquée à d’autres systèmes, tels que d’autres métalloenzymes. N’oubliez pas que travailler dans une boîte à gants peut être difficile, alors prenez soin de ne pas vous précipiter tout en exécutant cette technique.
