这种方法可以帮助回答组织修复和再生领域有关细胞保护通路、氧化应激和伤口愈合反应之间的关联性方面的关键问题。这种强大的技术的主要优点是，您可以实时测量伤口中的活性氧种类，以确定它们对组织再生的影响。与我展示这个程序的将是詹妮弗·光，一个实验室的研究助理。
使用血糖仪测量每只麻醉的8至12周大糖尿病小鼠的血糖。并使用头发修剪剂和脱毛霜去除第一动物的后毛。使用酒精擦拭两次清洁裸露的皮肤，并覆盖动物，使只有手术区暴露。
当酒精干燥时，使用无菌的10毫米活检冲孔，根据成熟的切除伤口愈合技术，产生两个10毫米全厚度伤口，通过潘尼库鲁斯肌龙体。使用 0.5 毫米厚的硅胶片，带 10 毫米圆形切口，将伤口夹开，用中断的 4/0 丝线缝合固定伤口。然后将小鼠放在热垫上，进行监测，直到完全恢复，然后返回其单独的笼子，提供纸巾作为额外的筑巢材料两周。
第二天，将控制无稽之谈小干扰RNA凝胶或实验性小干扰Keap1凝胶应用到每个动物的伤口顶部，用透明薄膜敷料包裹每个躯干，以保持凝胶就位，同时保持四肢自由。在实验的第三天，将一毫米注射器装上一个装有27规格的针头，并装上新准备的L-012溶液，并包裹注射器，以保护溶液免受光线的光。要成像伤口，请轻轻从每只小鼠身上取下透明膜敷料，而不干扰伤口，将小鼠放入生物发光成像系统的成像室。
将成像系统流入和感应室氧含量设置为每分钟一升，并在基线上通过生物发光和明亮场对小鼠进行成像。接下来，用酒精湿巾擦拭腹部，然后每200克体重注射5毫克L-012溶液，IP，一旦酒精干燥，注入每只小鼠。注射L-012溶液而不干扰后皮的伤口至关重要，因为任何变形都会影响伤口愈合轨迹和数据解释。
确保动物在注射前安全地在背背下。注射后，立即将小鼠放回成像室中各自的位置，并在60分钟的成像周期内每四分钟对小鼠进行一次成像，将10毫米伤口定义为确定活性氧物种水平的感兴趣区域。然后将小鼠放在热垫上，进行监测，直到完全恢复，然后再将动物返回到各自的笼子。
根据既定的切除伤口模型创建双边伤口三天后，在L-012注射之前未观察到生物发光。在内酮内L-012溶液注射后，在检测到活性氧物种的伤口区域观察到生物发光。在 60 分钟内每 4 到 5 分钟记录一分钟的生物发光记录，可显示感兴趣的区域随着时间的推移，最佳成像时间达到完整的 L-012 饱和度，约 50 分钟。
然后，可以通过将光强的总计数除以该区域来计算每个伤口区域中对L-012注射到无稽之谈小干扰RNA治疗或Keap1小干扰RNA治疗小鼠的生物发光。分析第10天伤口组织部分，以确认通过H&E染色进行活性氧物种水平测量的准确性，发现与小型干扰性无意义处理组织相比，细胞渗透到小干扰Keap1治疗的伤口中，表明实验性凝胶处理动物的炎症形态减少。F4/80的免疫反应，一种在伤口组织部分的蛋白质巨噬细胞标记，表明与小干扰性无意义治疗的伤口相比，小干扰Keap1治疗伤口的巨噬细胞数量减少，进一步突出了这种方法的正确性。
尝试此过程时，请确保确认 L-012 未过期，并在受光线保护的位置搅拌溶液。按照这个程序，靶向探针和基于免疫测定的方法可用于研究活性氧物种及其相关物的亚细胞定位，从而能够快速评估影响伤口重用统计的干预措施和机制。
