الهدف من هذه الإجراءات هو تقييم سلامة أغشية الحيوانات المنوية باستخدام مسابير فلورية محددة مقترنة بالمجهر الفلوري أو تحليل تدفق الخلايا. قد تساعد هذه التقنيات في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التكاثر مثل التنبؤ بإمكانيات الإخصاب وجودة عينة الحيوانات المنوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات هي أنها تمكن من إجراء تقييم دقيق لأغشية الحيوانات المنوية المتعددة التي من المعروف أنها ترتبط بإمكانيات تخصيب الحيوانات المنوية.
الآثار المترتبة على هذه التقنيات تمتد نحو تشخيص جودة السائل المنوي كما أنها تمكن من تقييم أكثر دقة من بلازما الحيوانات المنوية وسلامة الغشاء acrosome، فضلا عن إمكانات غشاء الميتوكوندريا. لبدء هذا الإجراء، الحصول على ما يقرب من 1-6 ملليلتر من السائل المنوي الثور في أنبوب 15 ملليلتر في درجة حرارة الغرفة. إضافة ستة ملليلتر من المخزن المؤقت NKM قبل warmed إلى 37 درجة مئوية لكل ملليلتر من السائل المنوي.
أجهزة الطرد المركزي في 600 مرة ز لمدة ثماني دقائق. كرر الطرد المركزي مرة أو مرتين حتى يكون المُندفع غير واضح. بعد هذا، على الفور تجاهل معظم من فوق، وترك ما يقرب من سنتيمتر واحد من فوق بيليه.
تميل بعناية الأنابيب في زاوية 30 درجة في الحاضنة وانتظر 20 إلى 30 دقيقة للسماح للحيوانات المنوية للسباحة. باستخدام micropipette، وإزالة بعناية المليلتر واحد المتبقية من عظمى الذي يحتوي الآن على الحيوانات المنوية motile ونقلها إلى أنبوب 1.5 ملليلتر الطازجة. حافظ على الحيوانات المنوية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
أولاً، إعداد كافة الحلول المطلوبة الأسهم كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك، نقل 133 ميكرولترات من الحيوانات المنوية المتحركة بتركيز 25 مليون من الحيوانات المنوية لكل ملليلتر إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. إضافة 17 ميكرولترات من حل العمل DAPI واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
جهاز طرد مركزي في 1،000 مرات ز لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وإضافة 100 ميكرولترات من المخزن المؤقت NKM إلى بيليه. بعد ذلك، إضافة 50 ميكرولترات من FITC-PSA، واثنين من microliters من JC-1، وثلاثة microliters من PI. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
جهاز طرد مركزي في 1،000 مرات ز لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وإعادة فرض بيليه في 40 ميكرولترات من المخزن المؤقت NKM. ثم نقل 10 ميكرولترات من العينة إلى شريحة زجاجية.
تشويه العينة وإضافة غطاء. بعد ذلك، تبدأ على الفور تصور العينة عن طريق المجهر epifluorescence مع هدف 40X وتصفية الثلاثي كما هو مبين في بروتوكول النص، وذلك باستخدام كاميرا رقمية لالتقاط صورة منفصلة لكل مرشح. استخدم خيار الدمج في برنامج الكاميرا لدمج الصور الثلاث التي تم تلقيها من الفلاتر، وحفظ الملف الجديد بتنسيق JPEG.
افتح الصورة المدمجة باستخدام أداة الطلاء واستخدم خيار الفرشاة لوضع علامة على الحيوانات المنوية التي تم عدها. بعد ذلك ، تصنيف الحيوانات المنوية على أساس الفلوريسنس المنبعث من كل مسبار ، مع التأكد من تقييم ما لا يقل عن 200 spermatozoa لكل شريحة. يجب أن تظهر كافة الخلايا باللون الأزرق من DAPI.
عد الخلايا الميتة، التي تظهر باللون الأرجواني، لتقييم الجدوى. ثم استخدام أنماط من تلطيخ الفلوريسنس لتقييم حالة أكروبسوم. وأخيرا، تقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا من خلال التمييز بين الحيوانات المنوية مع ارتفاع إمكانات غشاء الميتوكوندريا التي تظهر منتصف أحمر ملون من الحيوانات المنوية مع انخفاض إمكانات غشاء الميتوكوندريا التي تظهر منتصف الخضراء الملون.
عد منتصفات حمراء وخضراء بشكل منفصل وحساب نسبتها. لبدء تقييم سلامة غشاء البلازما، خذ العدد المطلوب من الآبار من مجموعة القدرة على البقاء والتركيز. قم بنقل الآبار إلى قاعدة العمل واغطيها بغطاء مرن لحمايتها من الضوء.
إضافة 199 ميكرولترات من محلول المخزنة مؤقتاً لcytometry إلى كل بئر. ثم إضافة ميكرولتر واحد من السائل المنوي المتجانسة بتركيز 57 مليون خلية لكل ملليلتر إلى كل بئر والتجانس عن طريق الأنابيب. غطي الطبق بالغطاء ويحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
بعد ذلك، قم بتشغيل العينة من خلال مقياس التدفق باستخدام إعداد قابلية البقاء. للبدء في تقييم إمكانات غشاء الميتوكوندريا، أخرج العدد المطلوب من الآبار من مجموعة أنشطة الميتوكوندريا. تحويلها إلى قاعدة العمل.
إضافة 10 ميكرولترات من الإيثانول المطلق إلى كل بئر واستخدام ماصة لإعادة تعليق مسحوق موجود داخل البئر. إضافة 190 ميكرولترس من برنامج تلفزيوني في بئر ومتجانسة عن طريق pipetting. إضافة 0.75 ميكرولترات من المني المتجانسة بتركيز 57 مليون خلية لكل ملليلتر إلى كل بئر والتجانس عن طريق الأنابيب.
غطي الطبق بالغطاء ويحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بتشغيل العينة من خلال مقياس تدفق السيّد باستخدام إعداد نشاط الميتوكوندريا. للبدء في تقييم سلامة الغشاء الأكروزومية ، أخرج العدد المطلوب من الآبار من مجموعة النزاهة الحيوية والمكرة.
قم بنقل الآبار إلى قاعدة العمل واغطيها بغطاء مرن لحمايتها من الضوء. إضافة 200 ميكرولترات من محلول المخزن المؤقت لcytometry لكل بئر. ثم إضافة 0.7 ميكرولترات من السائل المنوي المتجانسة بتركيز 57 مليون خلية لكل ملليلتر إلى كل بئر وتجانس عن طريق الأنابيب.
غطي الطبق بالغطاء ويحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك، قم بتشغيل العينة من خلال مقياس التدفق باستخدام إعداد البصيرة. في هذه الدراسة، يتم تقييم نوعية السائل المنوي باستخدام تقنيات مختلفة، واحدة منها تقييم أغشية الحيوانات المنوية باستخدام المسابير الفلوروميترية.
من الممكن تقييم الاختلافات في نوعية عينة الحيوانات المنوية من حيث سلامة الأغشية. على سبيل المثال، كان السائل المنوي للثيران رقم سبعة نسبة منخفضة نسبيا من الخلايا الميتة، ونسبة منخفضة من الحيوانات المنوية مع acrosome الزائفة رد فعل، وارتفاع إمكانات غشاء الميتوكوندريا بالمقارنة مع السائل المنوي للثور رقم واحد. ثم يتم تقييم العينات لقابلية البقاء والنشاط الميتوكوندريا.
تمثل الرسوم البيانية لهذه الأمثلة التمثيلية الحيوانات المنوية غير المُبَرَّد والحطام والحيوانات المنوية المسورة. وتمثل هذه المدرجات أيضا الخلايا القابلة للحياة والميت وتوزيع الحيوانات المنوية إلى غشاء الميتوكوندريا المستقطب والمستقطب. ثم يتم تقييم سلامة acrosome مع مجموعة جاهزة للاستخدام وقراءة مع تدفق القياسات الخلية، وتقسيم المنطقة إلى ثلاث مناطق علامة التي تمثل الخلايا الفلورية المنخفضة لا تذكر مع الخلايا الحمراء غير المطّهية سليمة، والخلايا الفلورية المنخفضة مع جزء ملطخ المتبقية من acrosome، وخلايا الفلورة عالية مع acrosome تعطلت.
أثناء محاولة هذه الإجراءات، من المهم التأكد من إعداد عينة الحيوانات المنوية الأولية بشكل صحيح. هذه التقنيات يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في تقييم جودة الحيوانات المنوية ويمكن تطبيقها على الكائنات الحية المختلفة مثل الأبقار والدواجن والإنسان. المقارنة بين التقنيتين، وتلطيخ رباعية والتدفق قياس الخلايا لم يدل على وجود اختلافات كبيرة في القدرة على البقاء، وإمكانية غشاء الميتوكوندريا، والسلامة acrosome تكشف أن التقنيات اثنين أنتجت نتائج مطابقة.
