精子膜评价的荧光技术

这些程序的目标是使用特定的荧光探针与荧光显微镜或流式细胞学分析相结合来评估精子膜的完整性。这些技术可能有助于回答生殖领域的关键问题，如预测受精潜力和精子样本的质量。这些技术的主要优点是，它们能够精确评估已知与精子受精潜力关联的多个精子膜。

这些技术的影响延伸到射精质量的诊断，因为它能够更准确地评估精子血浆和杂技膜的完整性以及线粒体膜电位。要开始这个程序，在室温下在15毫升管中获取大约1到6毫升的公牛精液。将六毫升 NKM 缓冲液预热至 37 摄氏度，每毫升精液。

在 600 次 g 下离心 8 分钟。重复离心一次或两次，直到上清液清晰。在此之后，立即丢弃大部分上经剂，在颗粒上方留下大约一厘米的上经液。

小心地将管子以30度角倾斜在培养箱中，等待20至30分钟，让精子游起来。使用微管，小心地去除剩余的一毫升上那液，现在含有动量精子，并将其转移到一个新的1.5毫升管。将精子保持在37摄氏度，直到准备好使用。

首先，准备文本协议中概述的所有所需库存解决方案。接下来，将每毫升浓度为2500万精子的133微升的精子转移到新的1.5毫升管中。加入 17 微升的 DAPI 工作溶液，在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。

在1000次g下离心5分钟。丢弃上流液，在颗粒中加入100微升的NKM缓冲液。接下来，添加 50 微升 FITC-PSA、JC-1 的 2 微升和 3 微升的 PI。在37摄氏度下孵育10分钟。

在1000次g下离心5分钟。丢弃上流液，将颗粒重新在 40 微升 NKM 缓冲液中。然后将样品的 10 微升转移到玻璃幻灯片中。

涂抹样品并添加盖玻片。在此之后，立即开始使用荧光显微镜对样品进行可视化，该视像为 40 倍，并且使用文本协议中概述的三重滤镜，使用数码相机为每个滤镜捕获单独的图像。使用相机软件中的合并选项合并从过滤器接收的三个图像，以 JPEG 格式保存新文件。

使用油漆工具打开合并的图像，并使用画笔选项标记已计数的精子。接下来，根据每个探针发出的荧光对精子进行分类，确保每张幻灯片至少评估200个精子。所有单元格应从 DAPI 显示为蓝色。

计算显示为紫色的死细胞，以评估生存能力。然后使用荧光染色模式来评估杂技状态。最后，通过区分具有高线粒体膜电位的精子粒体膜电位来评估线粒体膜电位，该精子具有红色染色的中片，具有低线粒体膜电位，具有绿色染色的中层。

分别计算红色和绿色中间件并计算其比率。要开始等离子膜完整性评估，请从可行性和浓度套件中选择所需的井数。将水井转移到工作基座上，用灵活的盖子盖住它们，以保护其免受光线的光。

在每个井中加入199微升缓冲溶液，用于细胞测量。然后以每毫升5700万个细胞的浓度加入一微升的同质精液，通过移液进行均质化。用盖子盖住盘子，在37摄氏度下孵育10分钟。

在此之后，使用可行性设置在流量环流仪中运行样本。要开始评估线粒体膜电位，请从线粒体活性试剂盒中拿出所需的井数。将它们转移到工作基地。

在每个井中加入10微升绝对乙醇，并使用移液器重新暂停井内的粉末。每井添加 190 微升 PBS，通过移液均质。在每一井中加入0.75微升的同质精液，每毫升浓度为5700万细胞，通过移液使其均质。

用盖子盖住盘子，在37摄氏度下孵育30分钟。在此之后，使用线粒体活性设置通过流式细胞仪运行样本。要开始评估杂技膜的完整性，请从可行性和杂技完整性套件中拿出所需的孔数。

将水井转移到工作基座上，用灵活的盖子盖住它们，以保护其免受光线的光。在每个井中加入200微升缓冲溶液，用于细胞测量。然后以每毫升5700万个细胞的浓度加入0.7微升的同质精液，通过移液使均质化。

用盖子盖住盘子，在37摄氏度下孵育45分钟。在此之后，使用洞察设置在流式测速仪中运行样本。在这项研究中，用不同的技术评估精液质量，其中一种技术使用荧光探针评估精子膜。

可以评估精子样本质量在膜完整性方面的差异。例如，与公牛一号射精相比，牛7号射精的死细胞比例相对较低，具有伪反应杂技体的精子比例较低，线粒体膜电位较高。然后对样本进行可行性和线粒体活性评估。

这些代表性示例的直方图代表未被污染的精子和碎片以及封闭的精子。这些直方图也代表活细胞和死细胞以及精子与极化和去极化线粒体膜的分布。然后用即用的试剂盒进行评估，然后用流动的细胞学读取，将该区域划分为三个标记区域，这些区域表示可忽略不计的低荧光细胞，具有完好无损的杂技体、低荧光细胞，其中残留的杂技部分，以及具有被破坏的杂技细胞的极致。

在尝试这些程序时，重要的是要确保正确准备初始精子样本。这些技术可以提供精子质量评估的见解，并可以应用于各种生物体，如牛，家禽和人类。两种技术之间的比较，四重染色和流式细胞学表明，在生存能力、线粒体膜电位和杂技完整性方面没有显著差异，表明这两种技术产生了匹配的结果。