Das Ziel dieser Verfahren ist es, die Integrität der Spermienmembranen mithilfe spezifischer Fluoreszenzsonden in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrieanalyse zu bewerten. Diese Techniken könnten helfen, schlüsselhafte Fragen auf dem Gebiet der Reproduktion zu beantworten, wie die Vorhersage des Befruchtungspotenzials und die Qualität der Spermienprobe. Der Hauptvorteil dieser Techniken ist, dass sie eine präzise Auswertung mehrerer Spermienmembranen ermöglichen, von denen bekannt ist, dass sie mit dem Befruchtungspotenzial von Spermien in Verbindung gebracht werden.
Die Implikationen dieser Techniken reichen bis zur Diagnose der Ejakulatqualität, da sie eine genauere Bewertung des Spermienplasmas und der Akrosomenmembranintegrität sowie des mitochondrialen Membranpotenzials ermöglicht. Um dieses Verfahren zu beginnen, erhalten Sie etwa ein bis sechs Milliliter Bullensamen in einem 15 Milliliter Rohr bei Raumtemperatur. Fügen Sie sechs Milliliter NKM-Puffer vorgewärmt auf 37 Grad Celsius zu jedem Milliliter Samen.
Zentrifuge bei 600 mal g für acht Minuten. Wiederholen Sie die Zentrifugation ein- oder zweimal, bis der Überstand klar ist. Danach sollten Sie den größten Teil des Überstandes sofort entsorgen und etwa einen Zentimeter Überstand über dem Pellet zurücklassen.
Lehnen Sie die Röhren vorsichtig in einem 30-Grad-Winkel im Inkubator und warten Sie 20 bis 30 Minuten, damit die Spermatozoen nach oben schwimmen können. Mit einer Mikropipette den restlichen 1 Milliliter Überstand, der nun die motile Spermatozoe enthält, vorsichtig entfernen und in eine frische 1,5-Milliliter-Röhre übertragen. Halten Sie das Sperma bei 37 Grad Celsius, bis sie einsatzbereit sind.
Bereiten Sie zunächst alle erforderlichen Bestandslösungen vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Als nächstes übertragen Sie 133 Mikroliter der motilen Spermatozoen in einer Konzentration von 25 Millionen Spermien pro Milliliter auf eine neue 1,5 Milliliter Tube. 17 Mikroliter der DAPI-Arbeitslösung hinzufügen und bei 37 Grad Celsius 10 Minuten brüten.
Zentrifuge bei 1 000 mal g für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie dem Pellet 100 Mikroliter NKM-Puffer hinzu. Als nächstes fügen Sie 50 Mikroliter FITC-PSA, zwei Mikroliter JC-1 und drei Mikroliter PI hinzu. Bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren.
Zentrifuge bei 1 000 mal g für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 40 MikroliterN NKM-Puffer wieder auf. Dann 10 Mikroliter der Probe auf eine Glasrutsche übertragen.
Verschmieren Sie die Probe, und fügen Sie einen Deckzettel hinzu. Danach beginnen Sie sofort mit der Visualisierung der Probe durch Epifluoreszenzmikroskopie mit einem 40-fachen Objektiv und einem Dreifachfilter, wie im Textprotokoll beschrieben, mit einer Digitalkamera, um ein separates Bild für jeden Filter zu erfassen. Verwenden Sie die Seriendruckoption in der Kamerasoftware, um die drei von den Filtern empfangenen Bilder zusammenzuführen und die neue Datei im JPEG-Format zu speichern.
Öffnen Sie das zusammengeführte Bild mit dem Malwerkzeug und verwenden Sie die Pinseloption, um die gezählte Spermatozoe zu markieren. Als nächstes klassifizieren Sie die Spermatozoen basierend auf der fluoreszenz emittierten Fluoreszenz von jeder Sonde, um sicherzustellen, dass mindestens 200 Spermatozoen pro Folie ausgewertet werden. Alle Zellen sollten aus der DAPI blau angezeigt werden.
Zählen Sie die abgestorbenen Zellen, die violett erscheinen, um die Lebensfähigkeit zu bewerten. Verwenden Sie dann die Muster der Fluoreszenzfärbung, um den Akrosomenstatus zu bewerten. Abschließend, bewerten Sie das mitochondriale Membranpotenzial, indem Sie die Spermatozoen mit hohem mitochondrialen Membranpotential unterscheiden, die ein rot gefärbtes Mittelstück von der Spermatozoen mit niedrigem mitochondrialen Membranpotenzial aufweisen, die ein grün gefärbtes Mittelstück aufweisen.
Zählen Sie rote und grüne Mittelstücke separat und berechnen Sie ihr Verhältnis. Um die Plasmamembranintegritätsbewertung zu beginnen, nehmen Sie die gewünschte Anzahl von Brunnen aus dem Lebensfähigkeits- und Konzentrationskit. Übertragen Sie die Brunnen auf die Arbeitsbasis und bedecken Sie sie mit einem flexiblen Deckel, um sie vor Licht zu schützen.
Fügen Sie 199 Mikroliter gepufferte Lösung für Zytometrie zu jedem Brunnen hinzu. Dann fügen Sie einen Mikroliter homogenen Samen in einer Konzentration von 57 Millionen Zellen pro Milliliter zu jedem Brunnen und homogenisieren durch Pipettieren. Bedecken Sie die Platte mit dem Deckel und brüten bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten.
Führen Sie anschließend die Probe mithilfe der Lebensfähigkeitseinstellung durch das Durchflusszytometer. Um mit der Bewertung des mitochondrialen Membranpotentials zu beginnen, nehmen Sie die gewünschte Anzahl von Brunnen aus dem mitochondrialen Aktivitätskit heraus. Übertragen Sie sie an die Arbeitsbasis.
Fügen Sie 10 Mikroliter absolutes Ethanol in jeden Brunnen und verwenden Sie eine Pipette, um das Pulver im Brunnen wieder aufzuhängen. 190 Mikroliter PBS pro Brunnen hinzufügen und durch Pipettieren homogenisieren. Fügen Sie 0,75 Mikroliter homogenen Samens mit einer Konzentration von 57 Millionen Zellen pro Milliliter zu jedem Brunnen hinzu und homogenisieren Sie ihn durch Pipettieren.
Bedecken Sie die Platte mit dem Deckel und brüten bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Führen Sie anschließend die Probe durch das Durchflusszytometer mit der Einstellung für die mitochondriale Aktivität. Um mit der Bewertung der akrosomalen Membranintegrität zu beginnen, nehmen Sie die gewünschte Anzahl von Brunnen aus dem Machbarkeits- und Akrosomenintegritätskit heraus.
Übertragen Sie die Brunnen auf die Arbeitsbasis und bedecken Sie sie mit einem flexiblen Deckel, um sie vor Licht zu schützen. Fügen Sie 200 Mikroliter gepufferte Lösung für Zytometrie zu jedem Brunnen. Dann fügen Sie 0,7 Mikroliter homogenen Samen sinieren mit einer Konzentration von 57 Millionen Zellen pro Milliliter zu jedem Brunnen und homogenisieren durch Pipettieren.
Bedecken Sie die Platte mit dem Deckel und brüten Bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten. Führen Sie anschließend die Probe mithilfe der Einsichtseinstellung durch das Durchflusszytometer. In dieser Studie wird die Samenqualität mit verschiedenen Techniken bewertet, von denen eine Spermienmembranen mit fluorometrischen Sonden bewertet.
Es ist möglich, die Unterschiede in der Qualität der Spermienprobe in Bezug auf die Membranintegrität zu bewerten. Zum Beispiel hatte das Ejakulat von Bullen Nummer sieben einen relativ niedrigen Prozentsatz abgestorbener Zellen, einen geringen Anteil an Spermien mit pseudo-reagiertem Akrosom und ein höheres mitochondriales Membranpotenzial im Vergleich zum Ejakulat von Stier Nummer eins. Die Proben werden dann auf Ihre Lebensfähigkeit und mitochondriale Aktivität untersucht.
Die Histogramme für diese repräsentativen Beispiele stellen die ungebiose Spermatozoe und Trümmer und die gated spermatozoa dar. Diese Histogramme stellen auch die lebensfähigen und abgestorbenen Zellen und die Verteilung von Spermatozoen auf polarisierte und depolarisierte mitochondriale Membran dar. Die Akrosomenintegrität wird dann mit einem gebrauchsfertigen Kit ausgewertet und mit Durchflusszytometrie gelesen, wobei der Bereich in drei Markerbereiche unterteilt wird, die vernachlässigbare niedrige Fluoreszenzzellen mit intakten, nicht befleckten Akrosomzellen, niedrig fluoreszierenden Zellen mit Restfärbung des Akrosoms und hochfluoreszierenden Zellen mit gestörtem Akrosom darstellen.
Beim Versuch dieser Verfahren, Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die erste Spermienprobe richtig vorzubereiten. Diese Techniken können Einblicke in die Bewertung der Spermienqualität geben und können auf verschiedene Organismen wie Rinder, Geflügel und Menschen angewendet werden. Ein Vergleich zwischen den beiden Techniken, vierfache Färbung und Durchflusszytometrie zeigte keine signifikanten Unterschiede in Derkotolierung, mitochondriale Membranpotenzial, und die Akrosome-Integrität zeigt, dass die beiden Techniken matching Ergebnisse produziert.
