إجراء شامل لتقييم التفاعل بين بروتين مكمل C1q وحمض الهيالورونيك في تعزيز التصاق الخلية. لقد حددنا مؤخرا أن مكون مكمل C1q جزيء من الجهاز المناعي الفطري وأعرب عن ذلك بشدة في الورم والمشيمة microenvironment وقادرة على التفاعل مع عنصر من المصفوفة خارج الخلية. في هذه الحالة، حمض الهيالورونيكس.
نقترح طريقة لدراسة الوظائف البيولوجية للبروتينات في جميع أنحاء البيئة الأكرونية. من أجل التحقيق في قدرة هذه الجزيئات على تشكيل خصائص انقسام الخلية من عوامل مصفوفة خارج الخلية. من أجل دراسة كيف يمكن أن يكون هذا التفاعل يمكن أن يكون متحسسا من قبل الخلايا الموجودة في أنسجة البيئة، وضعنا هذه الطريقة السهلة التي سمح للخلايا الثنائية المستمدة من الأنسجة البشرية إلى التمسك C1q ملزمة مصفوفة خارج الخلية، في هذه الحالة حمض الهيالوروني.
لإجراء الطلاء الخطوة الأولى هي ربط حمض الهيالورونيكس الوزن الجزيئي العالي إلى 96 طلاء الأنسجة جيدا microplate. للطلاء، يتم تخفيف حمض الهيالوروك في 0.1 مول الكربون العازل PH 9.6 بتركيز 15 ميكروغرام لكل ملليلتر. ويتم requited الأنابيب بلطف لتحقيق حل متجانس.
وتستخدم 100 ميكروليتر من الحل لمعطف الآبار. ثم يتم نقل اللوحة عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. اليوم التالي فراغ التعرق الآبار المعالجة.
غسل مرة واحدة مع dPBS. يضاف إما C1q أو BSA في الآبار المقابلة. C1q هو في الوقت الحاضر متاحة تجاريا بتركيز واحد ملليغرام لكل ملليلتر، ويتم تخفيفه بتركيز 25 ميكروغرام لكل ملليلتر.
وdPBS تحتوي على 0.5٪ BSA و 0.7 ملليمول الكالسيوم والمغنيسيوم والكاتيونات المغنية. يستخدم BSA LPS الحرة في تركيز 0.5٪ والتاريخ PBF. ثم يتم نقل لوحة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.
يتم تحديد التفاعلات C1q تعتمد الجرعة مع حمض الهيالورونيم شل الحركة من قبل إنزيم مرتبط مناعي SA. الخلايا التي تحمل علامات مع DiI سريع. يتم استخدام ديي شفة سريعة لتسمية الخلايا من الفائدة. وتستخدم الخلايا التي يتم إعادة اعتمادها في dPBS بتركيز مليون خلية لكل ملليلتر.
يتم تخفيف DiI سريع واحد إلى 100 مباشرة في تعليق الخلية. يتم خلط تعليق الخلية يدويًا ونقله عند درجة 37 مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد خمس دقائق حضانة، مزيج تعليق الخلية وتكرار هذه العملية مرتين أكثر.
لإزالة الزائدة من DiI سريع، إضافة 10 ملليلتر من dPBS. محوري بلطف صعودا وهبوطا والطرد المركزي في 250 غرام لمدة سبع دقائق. Resuspend بيليه الخلية في ملليلتر واحد من مصل endophilical الإنسان المتوسطة الحرة في وجود 0.1 ٪BSA.
الخلايا التصاق على المصفوفات حمض الهيالوروني C1q. فراغ التعرق DPBS من الآبار المغلفة. توزيع 100 ميكرولترات من تعليق الخلية المسمى على الآبار المغلفة.
يتم أخذ 200 ميكرولترات من الخلايا المسماة بعيدا في أنبوب ependure لاستخدامها في توليد منحنى القياسية. احتضان لوحة لمدة 35 دقيقة في 37 درجة مئوية. أخرجي الصحن من الحاضنة
pirate بلطف الخلايا غير متوازن. غسل مرة واحدة مع dPBS تحتوي على 0.5٪ BSA و 0.7 ملليمول الكالسيوم والمغنيسيوم. ليس الخلايا المتمسكة بإضافة 200 ميكرولترات من العازلة تحلل.
في الوقت نفسه إعداد منحنى القياسية على تخفيف واحد إلى اثنين المسلسل من الخلايا المسمى في العازلة تحلل. قم بقراءة إشارة الفلوريس في جهاز F 200 T-can اللانهائي باستخدام 544 نانومتر كطول موجي مثير و590 نانومتر كطول موجة للانبعاثات. نتائج تمثيلية.
كما هو مبين في النتائج التمثيلية، فمن الواضح أن التصاق الخلية على حمض الهيالوروني وجدت C1q كما عززت بقوة بالمقارنة مع HA وحدها أو HA ملزمة BSA. يتم حساب النسبة المئوية للخلايا المنضمة على كل مصفوفة على أساس المنحنى القياسي. الاستنتاجات. في تجاربنا أولا وقبل كل تقييمنا قدرة المكون المكمل C12 لربط مصفوفة خارج الخلية في هذه الحالة حمض الهيالورونيكس باستخدام معدن أريسال.
ثانياً قمنا بتحليل قدرة الخلايا الأولية البشرية الملطخة بصبغة الفلورسنت لمتابعة حمض الهيالورونيكس المقيد. النموذج الذي اقترحناه في هذه الدراسة هو طريقة أسهل وأسرع وأرخص في بديل لنموذج 3D من السقالات مصفوفة خارج الخلية لتقييم على هذه الاستجابة الخلوية لمزيج من المحفزات.
