細胞接着促進における補体タンパク質C1qとヒアルロン酸の相互作用を評価するための包括的な手順。我々は最近、自然免疫系の分子であるC1qの補体が腫瘍および胎盤微小環境において高発現し、細胞外マトリックスの成分と相互作用することができると定義した。この場合、ヒアルロン酸。
タンパク質の生物学的機能をエクロノミック環境全体で研究する方法を提案する。これらの分子の能力を調べるため、細胞外マトリックス因子の細胞分裂特性を形成する。この相互作用が環境の組織に存在する細胞によってどのように感知できるかを研究するために、我々は、ヒト組織由来のバイナリ細胞が細胞外マトリックス(この場合はヒアルロン酸)に結合したC1qに付着することを許されるこの容易な方法を設定した。
コーティング手順の第1段階は、高分子量ヒアルロン酸を96ウェル組織被覆マイクロプレートに結合することである。コーティングの場合、ヒアルロン酸は、1ミリリットル当たり15マイクログラムの濃度で0.1モル炭素バッファーPH 9.6で希釈される。そして穏やかに配管は均質な解決を達成するために報される。
100マイクロリットルの溶液を使用して、ウェルをコーティングします。プレートは、一晩摂氏4度で移動します。翌日、処理された井戸を真空吸気する。
dPBSで一度洗います。対応するウェルに C1q または BSA を追加します。C1qは、今日では1ミリリットル当たり1ミリグラムの濃度で市販されており、1ミリリットル当たり25マイクログラムの濃度で希釈されています。
そして、0.5%BSAと0.7ミリモルカルシウムとマグネシウムと二価カチウムを含むdPBS。BSA LPS フリーは、0.5% および日付 PBF の濃度で使用されます。プレートは、一晩摂氏4度で移動します。
固定化ヒアルロン酸とのC1q用量依存相互作用は、酵素結合免疫SAによって決定される。高速 DiI でラベリングするセル。親油性トレーサー高速DiIは、対象の細胞にラベルを付けるために使用されます。dPBSで再懸濁した細胞は、1ミリリットル当たり100万個の細胞の濃度で使用される。
高速DiIは、細胞懸濁液に直接1〜100を希釈する。細胞懸濁液は手動で混合し、15分間摂氏37度で移動する。5分間のインキュベーションの後、細胞懸濁液を混ぜ、この操作をさらに2回繰り返します。
速いDiIの過剰を除去するために、dPBSの10ミリリットルを加える。250gで静かに上下に旋回し、遠心分離機を7分間回転させます。0.1%BSAの存在下でヒトの好酸血清遊離培地の1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。
ヒアルロン酸C1qマトリックスに対する細胞接着性。コーティングされた井戸からdPBSを真空吸引する。100マイクロリットルの標識された細胞懸濁液をコーティングされた井戸に分配する。
200マイクロリットルの標識された細胞は、標準的な曲線生成に使用されるエプ耐えチューブで分解される。プレートを摂氏37度で35分間インキュベートします。インキュベーターからプレートを取り出します。
バランスの取れた細胞をそっと吸引する。0.5%BSAと0.7ミリモルのカルシウムとマグネシウムを含むdPBSで1回洗浄します。200マイクロリットルのライシスバッファーを添加することにより接着細胞をlysする。
同時に、溶解バッファー内の標識された細胞の 1 ~ 2 つの連続希釈時に標準曲線を調製します。544ナノメートルを励起波長、590ナノメートルを発光波長として使用し、無限F200 T缶計測器で蛍光信号の読み取りを行います。代表結果。
代表結果に示すように、ヒアルロン酸に対する細胞接着は、HA単独またはHA結合BSAと比較して強く増強されたC1qを発見したのが明らかである。各マトリックスの接着セルのパーセントは、標準曲線に基づいて計算されます。結論。まず、補体成分C12が、この場合、ハイアルロン酸を有する金属を用いて細胞外マトリックスに結合する能力を評価した。
次に、蛍光色素で染色されたヒト初等細胞の能力を分析し、結合ヒアルロン酸を求めた。今回の研究で提案したモデルは、この細胞間応答を刺激の組み合わせに対する評価用に、細胞外マトリックス足場の3Dモデルに代わる、より速く、より安価な方法である。
