Ein umfassendes Verfahren zur Bewertung des Zusammenspiels zwischen dem Komplementprotein C1q und Hyaluronsäure bei der Förderung der Zelladhäsion. Wir haben vor kurzem definiert, dass die Komplementkomponente C1q ein Molekül des angeborenen Immunsystems stark im Tumor und Plazenta Mikroumgebung exprimiert ist und in der Lage ist, mit Einer komponente der extrazellulären Matrix zu interagieren. In diesem Fall Hyaluronsäure.
Wir schlagen eine Methode zur Untersuchung der biologischen Funktionen von Proteinen in der gesamten ekronomischen Umgebung vor. Um die Fähigkeit dieser Moleküle zu untersuchen, die Zellteilungseigenschaften von extrazellulären Matrixfaktoren zu formen. Um zu untersuchen, wie diese Wechselwirkung von den Zellen im Gewebe der Umwelt wahrgenommen werden kann, haben wir diese einfache Methode eingerichtet, bei der binäre Zellen aus menschlichen Geweben an C1q haften durften, die an die extrazelluläre Matrix gebunden sind, in diesem Fall Hyaluronsäure.
Für das Beschichtungsverfahren ist der erste Schritt die Bindung von hochmolekularer Hyaluronsäure an 96 gut gewebebeschichtete Mikroplatten. Für die Beschichtung wird Hyaluronsäure in 0,1 Mol Kohlenstoffpuffer PH 9.6 in einer Konzentration von 15 Mikrogramm pro Milliliter verdünnt. Und sanftes Pfeifen wird erwidert, um eine homogene Lösung zu erreichen.
Zur Beschichtung der Brunnen werden 100 Mikroliter der Lösung verwendet. Die Platte wird dann bei vier Grad Celsius über Nacht übertragen. Am nächsten Tag Vakuum aspirieren die behandelten Brunnen.
Einmal mit dPBS waschen. Fügen Sie entweder C1q oder BSA in die entsprechenden Bohrungen. C1q ist heute in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter kommerziell erhältlich und wird in einer Konzentration von 25 Mikrogramm pro Milliliter verdünnt.
Und dPBS mit 0,5%BSA und 0,7 Millimole Calcium und Magnesium und divalente Kationen. BSA LPS frei wird bei einer Konzentration von 0,5% und Datum PBF verwendet. Die Platte wird dann über Nacht bei vier Grad Celsius übertragen.
C1q dosisabhängige Wechselwirkungen mit immobilisierter Hyaluronsäure werden durch enzymgebundene Immun-SA bestimmt. Zellenbeschriftung mit schnellem DiI. Der lipophile Tracer schnell DiI wird verwendet, um die Zellen von Interesse zu kennzeichnen. Zellen, die in dPBS resuspendiert werden, werden in der Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter verwendet.
Fast DiI wird einbis 100 direkt in die Zellsuspension verdünnt. Die Zellsuspension wird manuell gemischt und bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten übertragen. Nach fünf Minuten Inkubation die Zellsuspension mischen und diesen Vorgang noch zweimal wiederholen.
Um den Überschuss an schnellem DiI zu entfernen, fügen Sie 10 Milliliter dPBS hinzu. Biegen Sie sieben Minuten lang sanft auf und ab und zentrieren Sie sich bei 250 g. Setzen Sie das Zellpellet in einem Milliliter des humanen endophilen Serum-freien Mediums in Gegenwart von 0,1%BSA aus.
Zellen Haftung auf Hyaluronsäure C1q Matrizen. Vakuum-Aspirat der dPBS aus den beschichteten Brunnen. Verteilen Sie 100 Mikroliter beschrifteter Zellsuspension auf die beschichteten Brunnen.
200 Mikroliter beschrifteter Zellen werden in einem Ependure-Rohr auseinandergenommen, um für die Standard-Kurvenerzeugung verwendet zu werden. Inkubieren Sie die Platte für 35 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator.
Die unausgewogenen Zellen vorsichtig ansaugen. Einmal mit dPBS mit 0,5%BSA und 0,7 Millimolen Calcium und Magnesium waschen. Lys die anhaftenden Zellen durch Zugabe von 200 Mikroliter Lysepuffer.
Gleichzeitig bereiten Sie die Standardkurve auf ein bis zwei serielle Verdünnung der beschrifteten Zellen im Lysepuffer vor. Führen Sie das Ablesen des Blütensignals bei unendlichen F 200 T-can-Instrumenten mit 544 Nanometern als Anregungswellenlänge und 590 Nanometern als Emissionswellenlänge durch. Repräsentative Ergebnisse.
Wie die repräsentativen Ergebnisse zeigen, ist es offensichtlich, dass die Zelladhäsion auf Hyaluronsäure C1q als stark verbessert im Vergleich zu HA allein oder HA gebundenb BSA fand. Der Prozentsatz der anhaftenden Zellen in jeder Matrix wird auf der Grundlage der Standardkurve berechnet. Schlussfolgerungen. In unseren Experimenten haben wir zunächst die Fähigkeit der Komplementkomponente C12 bewertet, die extrazelluläre Matrix in diesem Fall Hyaluronsäure mit einem Arisalmetall zu binden.
Zweitens analysierten wir die Fähigkeit menschlicher Primärzellen, die mit fluoreszierendem Farbstoff gefärbt sind, gebundene Hyaluronsäure zu verfolgen. Das Modell, das wir in dieser Studie vorgeschlagen haben, ist eine einfachere schnellere und billigere Methode als Alternative zum 3D-Modell von extrazellulären Matrixgerüsten für die Bewertung dieser zellulären Reaktion auf eine Kombination von Reizen.
