הליך מקיף להערכת יחסי הגומלין בין החלבון המשלים C1q לחומצה היאלורונית בקידום הידבקות בתאים. לאחרונהגדרנו כי המרכיב המשלים C1q מולקולה של המערכת החיסונית המולדת באה לידי ביטוי מאוד במיקרו-וירוס הגידול והשליה ומצליחה לקיים אינטראקציה עם רכיב המטריצה החוץ-תאית. במקרה זה, חומצה היאלורונית.
אנו מציעים שיטה לחקר הפונקציות הביולוגיות של חלבונים ברחבי הסביבה האקרונומית. על מנת לחקור את היכולת של מולקולות אלה לעצב את תכונות חלוקת התאים של גורמי מטריצה חוץ תאית. על מנת ללמוד כיצד אינטראקציה זו יכולה להיות מושגת על ידי התאים הקיימים ברקמת הסביבה, הגדרנו שיטה קלה זו שבה תאים בינאריים הנגזרים מרקמות אנושיות הורשו לדבוק C1q מאוגד מטריצה חוץ תאית, במקרה זה חומצה היאלורונית.
עבור הליך ציפוי הצעד הראשון הוא מחייב של חומצה היאלורונית במשקל מולקולרי גבוה ל 96 מיקרופלסטיק מצופה רקמות היטב. עבור ציפוי, חומצה היאלורונית מדוללת 0.1 חופרת פחמן חיץ PH 9.6 בריכוז של 15 מיקרוגרם למיליליטר. ובעדינות צינורות הוא requited כדי להשיג פתרון הומוגני.
100 מיקרוליטרים של הפתרון משמשים לציפוי בארות. לאחר מכן הצלחת מועברת בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה. למחרת ואקום שאף את הבאר המטופלת.
לשטוף פעם אחת עם dPBS. הוסף C1q או BSA בארות המתאימות. C1q זמין כיום מסחרית בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר והוא מדולל בריכוז של 25 מיקרוגרם למיליליטר.
ו-dPBS המכיל 0.5%BSA ו-0.7 מילימול סידן ומגנזיום ו- cations חלוקה. BSA LPS חינם משמש בריכוז של 0.5% ותאריך PBF. צלחת מועברת לאחר מכן בארבע מעלות צלזיוס לילה.
אינטראקציות תלויות מינון C1q עם חומצה היאלורונית משותקת נקבעת על ידי אנזים מקושר אימונו SA. תאים המתייגים באמצעות DiI מהיר. מעקב lipophilic מהיר DiI משמש כדי לתייג את התאים של עניין. תאים המתווסכלים ב- dPBS משמשים בריכוז של מיליון תאים למיליליטר.
ה-DiI המהיר מדולל בין 1 ל-100 ישירות לתוך ההשעיה של התא. ההשעיה התא מעורבב באופן ידני ומועבר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר חמש דקות דגירה, מערבבים את ההשעיה התא ולחזור על פעולה זו פעמיים נוספות.
כדי להסיר את עודף של DiI מהיר, להוסיף 10 מיליליטר של dPBS. יש לסובב בעדינות למעלה ולמטה ולהפוך לצנטריפוגה במהירות של 250 גרם למשך שבע דקות. תן מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של מדיום אנדופילי אנושי ללא סרום בנוכחות 0.1%BSA.
הידבקות בתאים על חומצה היאלורונית C1q מטריסות. ואקום שאף את ה- dPBS מה בארות מצופות. להפיץ 100 microliters של השעיית תא שכותרתו ל בארות מצופה.
200 מיקרוליטרים של תאים מסומנים מתפרקים בצינור תליון שישמש ליצרן עקומה סטנדרטי. דגירה את הצלחת במשך 35 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. תוציא את הצלחת מהחמה.
שאפו בעדינות את התאים הלא מאוזנים. יש לשטוף פעם אחת עם dPBS המכיל 0.5%BSA ו-0.7 מילימול סידן ומגנזיום. Lys התאים חסידים על ידי הוספת 200 microliters של מאגר תמיסת.
במקביל להכין את העקומה הסטנדרטית על אחד עד שניים דילול טורי של התאים המסווים במאגר תזה. בצע את הקריאה של אות florescence ב אינסוף F 200 T-can מכשיר באמצעות 544 ננומטרים כמו אורך גל העירור ו 590 ננומטר כמו אורך גל פליטה. תוצאות מייצגות.
כפי שמוצג על ידי התוצאות הייצוגיות, ניכר כי הידבקות התא על חומצה היאלורונית מצא C1q כמו משופרת מאוד בהשוואה HA לבד או HA קשור BSA. אחוז התאים החסידיים בכל מטריצה מחושב על בסיס העקומה הסטנדרטית. מסקנות. בניסויים שלנו קודם כל הערכנו את היכולת של הרכיב המשלים C12 לקשור את המטריצה החוץ תאית במקרה זה חומצה היאלורונית באמצעות מתכת אריסאלית.
שנית ניתחנו את היכולת של תאים ראשוניים אנושיים מוכתמים בצבע פלואורסצנטי לרדוף אחר חומצה היאלורונית קשורה. המודל שהצענו במחקר זה הוא שיטה קלה יותר ומהירה יותר וחלופה למודל תלת מימדי של פיגומי מטריצה חוץ-תאיים להערכה על תגובה תאית זו לשילוב של גירויים.
