Une procédure complète pour évaluer l’interaction entre la protéine complémentaire C1q et l’acide hyaluronique dans la promotion de l’adhérence cellulaire. Nous avons récemment défini que le composant de complément C1q une molécule du système immunitaire inné est fortement exprimée dans le microenvironnement de tumeur et de placenta et est capable d’interagir avec la composante de la matrice extracellulaire. Dans ce cas, l’acide hyaluronique.
Nous proposons une méthode pour étudier les fonctions biologiques des protéines dans tout l’environnement écronomic. Afin d’étudier la capacité de ces molécules à façonner les propriétés de division cellulaire des facteurs de matrice extracellulaire. Afin d’étudier comment cette interaction peut être détectée par les cellules présentes dans le tissu de l’environnement, nous avons mis en place cette méthode facile dans laquelle les cellules binaires dérivées des tissus humains ont été autorisés à adhérer à C1q lié à la matrice extracellulaire, dans ce cas l’acide hyaluronique.
Pour la procédure de revêtement, la première étape est la liaison de l’acide hyaluronique de poids moléculaire élevé à 96 microplaques enduites de tissu bien. Pour le revêtement, l’acide hyaluronique est dilué dans 0,1 tampon de carbone taupe PH 9,6 à une concentration de 15 microgrammes par millilitre. Et le pipeting doucement est requited pour réaliser une solution homogène.
Une 100 microlitres de la solution sont utilisés pour enrober les puits. La plaque est ensuite transférée à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, aspirez les puits traités.
Laver une fois avec dPBS. Ajouter c1q ou BSA dans les puits correspondants. C1q est aujourd’hui disponible dans le commerce à une concentration d’un milligramme par millilitre et il est dilué à une concentration de 25 microgrammes par millilitre.
Et dPBS contenant 0,5%BSA et 0,7 millimoles calcium et magnésium et cations divalent. BSA LPS libre est utilisé à la concentration de 0,5% et la date PBF. La plaque est ensuite transférée à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Les interactions dépendantes de la dose C1q avec l’acide hyaluronique immobilisé sont déterminées par immuno SA lié à l’enzyme. Étiquetage des cellules avec dii rapide. Le traceur lipophile rapide DiI est utilisé pour étiqueter les cellules d’intérêt. Les cellules résusées dans le DPBS sont utilisées à la concentration d’un million de cellules par millilitre.
Fast DiI est dilué de un à 100 directement dans la suspension cellulaire. La suspension cellulaire est mélangée manuellement et transférée à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après cinq minutes d’incubation, mélanger la suspension cellulaire et répéter cette opération deux fois de plus.
Pour éliminer l’excès de DiI rapide, ajouter 10 millilitres de dPBS. Pivotez doucement de haut en bas et centrifugez à 250 g pendant sept minutes. Resuspendez la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu sans sérum endophilique humain en présence de 0,1%BSA.
Adhérence des cellules sur l’acide hyaluronique C1q matrices. Aspirer sous vide le dPBS des puits enduits. Distribuez 100 microlitres de suspension cellulaire étiquetée aux puits enduits.
200 microlitres de cellules étiquetées sont démontés dans un tube d’épendure pour être utilisés pour la génération standard de courbes. Incuber la plaque pendant 35 minutes à 37 degrés Celsius. Sortez la plaque de l’incubateur.
Aspirez doucement les cellules déséquilibrées. Lavez-le une fois avec du dPBS contenant 0,5 % de BSA et 0,7 millimoles de calcium et de magnésium. Lys les cellules adhérentes en ajoutant 200 microlitres de tampon de lyse.
Dans le même temps préparer la courbe standard sur une à deux dilution en série des cellules étiquetées dans le tampon de lyse. Effectuez la lecture du signal de florescence à l’instrument infini F 200 T-can à l’aide de 544 nanomètres comme longueur d’onde d’excitation et de 590 nanomètres comme longueur d’onde d’émission. Résultats représentatifs.
Comme le montrent les résultats représentatifs, il est évident que l’adhérence cellulaire à l’acide hyaluronique a trouvé C1q aussi fortement amélioré par rapport à ha seul ou HA lié BSA. Le pourcentage de cellules adhérentes sur chaque matrice est calculé sur la base de la courbe standard. Conclusions. Dans nos expériences tout d’abord, nous avons évalué la capacité du composant de complément C12 à lier la matrice extracellulaire dans ce cas l’acide hyaluronique à l’aide d’un métal arisal.
Deuxièmement, nous avons analysé la capacité des cellules primaires humaines tachées de colorant fluorescent à poursuivre l’acide hyaluronique lié. Le modèle que nous avons proposé dans cette étude est une méthode plus rapide et moins chère en alternative au modèle 3D des échafaudages extracellulaires de matrice pour l’évaluation sur cette réponse cellulaire à une combinaison de stimulus.
