Una procedura completa per valutare l'interazione tra la proteina del complemento C1q e l'acido ialuronico nel promuovere l'adesione cellulare. Abbiamo recentemente definito che il componente del complemento C1q una molecola del sistema immunitario innato è altamente espressa nel microambiente tumorale e placenta ed è in grado di interagire con la componente della matrice extracellulare. In questo caso, acido ialuronico.
Proponiamo un metodo per studiare le funzioni biologiche delle proteine in tutto l'ambiente ecronomico. Al fine di studiare la capacità di queste molecole di modellare le proprietà di divisione cellulare dei fattori della matrice extracellulare. Per studiare come questa interazione possa essere percepibile dalle cellule presenti nel tessuto dell'ambiente, abbiamo impostato questo metodo semplice in cui le cellule binarie derivate dai tessuti umani sono state autorizzate ad aderire al C1q legato alla matrice extracellulare, in questo caso acido ialuronico.
Per la procedura di rivestimento il primo passo è il legame dell'acido ialuronico ad alto peso molecolare a 96 micropiacche rivestite di tessuto. Per il rivestimento, l'acido ialuronico viene diluito in tampone di carbonio PH 9,6 da 0,1 mole ad una concentrazione di 15 microgrammi per millilitro. E la pipettazione delicata viene corrisposta per ottenere una soluzione omogenea.
Per rivestire i pozzi vengono utilizzati 100 microlitri della soluzione. La piastra viene quindi trasferita a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno dopo il vuoto aspira i pozzi trattati.
Lavare una volta con dPBS. Aggiungere C1q o BSA nei pozzi corrispondenti. C1q è oggi disponibile in commercio con una concentrazione di un milligrammo per millilitro e viene diluito ad una concentrazione di 25 microgrammi per millilitro.
E dPBS contenente 0,5%BSA e 0,7 millimoli calcio e magnesio e formazioni divalenti. BSA LPS free viene utilizzato alla concentrazione dello 0,5% e data PBF. La piastra viene quindi trasferita a quattro gradi Celsius durante la notte.
Le interazioni dipendenti dalla dose di C1q con acido ialuronico immobilizzato sono determinate dall'immuno SA collegato all'enzima. Etichettatura delle celle con DiI veloce. Il dii veloce tracciante lipofilo viene utilizzato per etichettare le cellule di interesse. Le cellule resuspended in dPBS vengono utilizzate alla concentrazione di un milione di cellule per millilitro.
Fast DiI viene diluito da uno a 100 direttamente nella sospensione cellulare. La sospensione cellulare viene mescolata manualmente e trasferita a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo cinque minuti di incubazione, mescolare la sospensione cellulare e ripetere questa operazione altre due volte.
Per rimuovere l'eccesso di DiI veloce, aggiungere 10 millilitri di dPBS. Ruotare delicatamente su e giù e centrifugare a 250 g per sette minuti. Resuspend il pellet cellulare in un millilitro di mezzo endofilo umano privo di siero in presenza di 0,1%BSA.
Adesione delle cellule sulle matrici di acido ialuronico C1q. Il vuoto aspira il dPBS dai pozzi rivestiti. Distribuire 100 microlitri di sospensione cellulare etichettata ai pozzi rivestiti.
200 microlitri di celle etichettate sono smontati in un tubo di ependure da utilizzare per la generazione di curve standard. Incubare il piatto per 35 minuti a 37 gradi Celsius. Estraete il piatto dall'incubatrice.
Aspirare delicatamente le cellule sbilanciate. Lavare una volta con dPBS contenente 0,5%BSA e 0,7 millimoli calcio e magnesio. Lys le cellule aderenti aggiungendo 200 microlitri di tampone di lysis.
Allo stesso tempo preparare la curva standard su una o due diluizioni seriali delle celle etichettate nel tampone dilisi. Eseguire la lettura del segnale di florescence a uno strumento infinito F 200 T-can usando 544 nanometri come lunghezza d'onda di eccitazione e 590 nanometri come lunghezza d'onda di emissione. Risultati rappresentativi.
Come dimostrato dai risultati rappresentativi, è evidente che l'adesione cellulare all'acido ialuronico ha trovato C1q come fortemente migliorato rispetto al solo HA o al BSA legato all'HA. La percentuale di celle aderenti su ogni matrice viene calcolata sulla base della curva standard. Conclusioni. Nei nostri esperimenti abbiamo prima di tutto valutato la capacità del componente del complemento C12 di legare la matrice extracellulare in questo caso acido ialuronico usando un metallo arisale.
In secondo luogo abbiamo analizzato la capacità delle cellule primarie umane macchiate di colorante fluorescente di inseguire l'acido ialuronico legato. Il modello che abbiamo proposto in questo studio è un metodo più facile, più veloce ed economico in alternativa al modello 3D di impalcature a matrice extracellulare per la valutazione su questa risposta cellulare a una combinazione di stimoli.
