세포 접착을 촉진하는 보완 단백질 C1q와 히알루론산 간의 상호 작용을 평가하는 포괄적인 절차. 우리는 최근에 선천적인 면역 계통의 보충 성분 C1q가 종양 과 태반 미세 환경에서 높게 발현되고 세포외 매트릭스의 성분과 상호 작용할 수 있다는 것을 정의했습니다. 이 경우 히알루론산.
우리는 음경 환경 전반에 걸쳐 단백질의 생물학적 기능을 연구하는 방법을 제안합니다. 세포 외 매트릭스 인자의 세포 분열 특성을 형성하는 이러한 분자의 능력을 조사하기 위해. 이러한 상호작용이 환경의 조직에 존재하는 세포에 의해 어떻게 감지될 수 있는지 연구하기 위해, 인간 조직에서 유래한 이진 세포가 세포외 매트릭스에 결합된 C1q에 부착할 수 있는 이 쉬운 방법을 설정하여 히알루론산이다.
코팅 절차의 경우 첫 번째 단계는 96 잘 조직 코팅 마이크로 플레이트에 높은 분자량 히알루론산의 결합이다. 코팅의 경우, 히알루론산은 밀리리터당 15마이크로그램의 농도로 0.1 두더지 탄소 완충제 PH 9.6으로 희석된다. 그리고 부드럽게 파이프는 균일 한 솔루션을 달성하기 위해 재기재된다.
100 마이크로리터의 용액이 우물을 코팅하는 데 사용됩니다. 그런 다음 플레이트는 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 옮겨지도록 합니다. 다음날 진공 청소기는 처리된 우물을 흡인시합니다.
dPBS로 한 번 씻으시면 됩니다. 해당 우물에 C1q 또는 BSA를 추가합니다. C1q는 요즘 밀리 리터 당 1 밀리 그램의 농도에서 상업적으로 사용할 수 있으며 밀리 리터 당 25 마이크로 그램의 농도로 희석됩니다.
그리고 dPBS는 0.5%BSA 및 0.7 밀리몰드 칼슘과 마그네슘 및 이가지 양온을 함유하고 있습니다. BSA LPS 무료0.5%의 농도와 날짜 PBF에서 사용됩니다. 플레이트는 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 옮겨져 있습니다.
C1q 투여량은 면역SA와 연결된 효소에 의해 결정된다. 빠른 DiI로 라벨링하는 셀. 지방 혈 성 추적자 빠른 DiI관심의 세포를 레이블하는 데 사용됩니다. dPBS에서 재중단된 세포는 밀리리터당 백만 개의 세포의 농도에서 사용됩니다.
빠른 DiI는 세포 현탁액으로 직접 1~100을 희석한다. 셀 서스펜션은 수동으로 혼합되어 섭씨 37도에서 15분 동안 이송됩니다. 5분 간 배양 후 셀 서스펜션을 혼합하고 이 수술을 두 번 더 반복합니다.
빠른 DiI의 과잉을 제거하려면 dPBS의 10 밀리리터를 추가합니다. 7분간 250g에서 부드럽게 위아래로 위아래로 피벗합니다. 0.1%BSA의 존재에 인간 내성 혈청 무료 배지의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단.
히알루론산 C1q 행렬에 대한 세포 접착. 코팅 된 우물에서 dPBS를 흡입 진공. 코팅 된 우물에 라벨 이 부착 된 세포 현탁액의 100 마이크로 리터를 배포합니다.
표지된 세포의 200마이크로리터는 표준 곡선 생성에 사용되는 임시 튜브에서 분해됩니다. 섭씨 37도에서 35분 동안 접시를 배양합니다. 인큐베이터에서 접시를 꺼내.
불균형한 세포를 부드럽게 흡인합니다. 0.5%BSA와 0.7 밀리몰드 칼슘과 마그네슘을 함유한 dPBS로 한 번 세척하십시오. 용해 버퍼의 200 마이크로 리터를 추가하여 부착 된 세포를 lyss.
동시에 리시스 버퍼에서 표지된 셀의 1~2개의 직렬 희석시 표준 곡선을 준비합니다. 544 나노미터를 발산 파장으로 사용하고 590 나노미터를 방출 파장으로 사용하여 무한 F 200 T-can 계측기에서 플로레시프 신호의 판독을 수행한다. 대표적인 결과.
대표적인 결과에 의해 나타난 바와 같이, 히알루론산에 세포 접착은 HA 단독으로 또는 HA 바운드 BSA와 비교하여 강하게 강화된 C1q를 발견한 것이 분명하다. 각 매트릭스의 부착 셀의 백분율은 표준 곡선을 기준으로 계산됩니다. 결론. 우리의 실험에서 먼저 우리는 아리살 금속을 사용하여이 경우 히알루론산에서 세포외 매트릭스를 결합하는 보완 성분 C12의 능력을 평가했다.
둘째, 우리는 결합된 히알루론산을 추구하기 위하여 형광염으로 염색된 인간 1차 세포의 기능을 분석했습니다. 우리가 이 연구에서 제안한 모형은 자극의 조합에 이 세포 반응에 대한 평가를 위한 세포외 매트릭스 비계의 3D 모형에 대안에 있는 더 쉽고 싼 방법입니다.
