Un procedimiento integral para evaluar la interacción entre la proteína de complemento C1q y el ácido hialurónico en la promoción de la adhesión celular. Recientemente hemos definido que el componente de complemento C1q una molécula del sistema inmunitario innato está muy expresada en el microambiente tumoral y placenta y es capaz de interactuar con el componente de la matriz extracelular. En este caso, ácido hialurónico.
Proponemos un método para estudiar las funciones biológicas de las proteínas en todo el entorno ecronómico. Con el fin de investigar la capacidad de estas moléculas para dar forma a las propiedades de división celular de los factores de matriz extracelular. Con el fin de estudiar cómo esta interacción puede ser detectada por las células presentes en el tejido del medio ambiente, configuramos este método fácil en el que las células binarias derivadas de los tejidos humanos se les permitió adherirse a C1q unido a la matriz extracelular, en este caso ácido hialurónico.
Para el procedimiento de recubrimiento el primer paso es la unión de ácido hialurónico de alto peso molecular a 96 microplacas bien recubiertas de tejido. Para el recubrimiento, el ácido hialurónico se diluye en 0,1 mole buffer de carbono PH 9.6 a una concentración de 15 microgramos por mililitro. Y la tubería suave es requited para lograr una solución homogénea.
Se utilizan 100 microlitros de la solución para recubrir los pozos. La placa se transfiere a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente aspira el vacío de los pozos tratados.
Lavar una vez con dPBS. Agregue C1q o BSA en los pozos correspondientes. C1q está actualmente disponible comercialmente a una concentración de un miligramo por mililitro y se diluye a una concentración de 25 microgramos por mililitro.
Y dPBS que contiene 0.5%BSA y 0.7 milimolemoles calcio y magnesio y cationes divalentes. BSA LPS free se utiliza a la concentración de 0.5% y fecha PBF. La placa se transfiere a cuatro grados centígrados durante la noche.
Las interacciones dependientes de la dosis C1q con ácido hialurónico inmovilizado se determinan mediante inmuno SA vinculado a enzimas. Etiquetado de células con DiI rápido. El trazador lipofílico diI rápido se utiliza para etiquetar las células de interés. Las células resuspendidas en dPBS se utilizan a la concentración de un millón de células por mililitro.
DiI rápido se diluye de uno a 100 directamente en la suspensión celular. La suspensión celular se mezcla manualmente y se transfiere a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Después de cinco minutos de incubación, mezcle la suspensión celular y repita esta operación dos veces más.
Para eliminar el exceso de DiI rápido, agregue 10 mililitros de dPBS. Gire suavemente hacia arriba y hacia abajo y centrifugar a 250 g durante siete minutos. Resuspender el gránulo celular en un mililitro de medio libre de suero endofilo humano en presencia de 0.1%BSA.
Adhesión de células en matrices C1q de ácido hialurónico. Aspirar al vacío el dPBS de los pozos recubiertos. Distribuya 100 microlitros de suspensión celular etiquetada a los pozos recubiertos.
200 microlitros de células etiquetadas se desmontan en un tubo de ependure que se utilizará para la generación de curvas estándar. Incubar la placa durante 35 minutos a 37 grados centígrados. Saque el plato de la incubadora.
Aspirar suavemente las células desequilibradas. Lavar una vez con dPBS que contiene 0.5%BSA y 0.7 milimolemoles de calcio y magnesio. Lys las células adherentes mediante la adición de 200 microlitros de tampón de lelisis.
Al mismo tiempo, prepare la curva estándar sobre una o dos diluciones en serie de las células etiquetadas en el búfer de lelisis. Realice la lectura de la señal de florescencia en el infinito instrumento F 200 T-can utilizando 544 nanómetros como longitud de onda de excitación y 590 nanómetros como longitud de onda de emisión. Resultados representativos.
Como muestran los resultados representativos, es evidente que la adhesión celular en el ácido hialurónico encontró C1q como fuertemente mejorado en comparación con HA solo o HA unido BSA. El porcentaje de celdas adherentes en cada matriz se calcula sobre la base de la curva estándar. Conclusiones. En nuestros experimentos primero evaluamos la capacidad del componente de complemento C12 para unir la matriz extracelular en este caso el ácido hialurónico utilizando un metal arisal.
En segundo lugar analizamos la capacidad de las células primarias humanas manchadas con tinte fluorescente para perseguir el ácido hialurónico unido. El modelo que propusimos en este estudio es un método más fácil y barato en alternativa al modelo 3D de andamios de matriz extracelular para la evaluación de esta respuesta celular a una combinación de estímulos.
