Um procedimento abrangente para avaliar a interação entre a proteína complementar C1q e o ácido hialurônico na promoção da adesão celular. Recentemente definimos que o componente complementar C1q uma molécula do sistema imunológico inato é altamente expresso no microambiente tumor e placenta e é capaz de interagir com o componente da matriz extracelular. Neste caso, ácido hialurônico.
Propomos um método para estudar as funções biológicas das proteínas em todo o ambiente ecronômico. A fim de investigar a capacidade dessas moléculas de moldar as propriedades de divisão celular de fatores de matriz extracelular. Para estudar como essa interação pode ser sentida pelas células presentes no tecido do ambiente, estabelecemos esse método fácil no qual células binárias derivadas de tecidos humanos foram autorizadas a aderir ao C1q ligado à matriz extracelular, neste caso o ácido hialurônico.
Para o procedimento de revestimento, o primeiro passo é a ligação do ácido hialurônico de alto peso molecular a 96 microplacas revestidas de tecido. Para revestimento, o ácido hialurônico é diluído em 0,1 tampão de carbono mole PH 9.6 a uma concentração de 15 microgramas por mililitro. E a tubulação suave é correspondida para alcançar uma solução homogênea.
100 microliters da solução são usados para revestir os poços. A placa é então transferida a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, aspirar os poços tratados.
Lave uma vez com dPBS. Adicione C1q ou BSA nos poços correspondentes. C1q está hoje disponível comercialmente a uma concentração de um miligrama por mililitro e é diluído a uma concentração de 25 microgramas por mililitro.
E dPBS contendo 0,5% BSA e 0,7 mililitros de cálcio e magnésio e cáções divalentas. BSA LPS livre é usado na concentração de 0,5% e data PBF. A placa é então transferida a quatro graus Celsius durante a noite.
As interações dependentes da dose C1q com ácido hialurônico imobilizado são determinadas pela enzima ligada ao imuno SA. Rotulagem de células com DII rápido. O rastreador lipofílico rápido DiI é usado para rotular as células de interesse. As células resuspendadas em dPBS são usadas na concentração de um milhão de células por mililitro.
DiI rápido é diluído de 1 a 100 diretamente na suspensão da célula. A suspensão da célula é misturada manualmente e transferida a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após cinco minutos de incubação, misture a suspensão da célula e repita esta operação mais duas vezes.
Para remover o excesso de DII rápido, adicione 10 mililitros de dPBS. Gire suavemente para cima e para baixo e centrífuga a 250 g por sete minutos. Resuspend a pelota celular em um mililitro de soro endofilical humano sem meio na presença de 0,1%BSA.
Células adesão em matrizes de ácido hialurônico C1q. Aspirar a vácuo o dPBS dos poços revestidos. Distribua 100 microliters de suspensão celular rotulada aos poços revestidos.
200 microliters de células rotuladas são desmontados em um tubo de ependure para ser usado para a geração de curvas padrão. Incubar a placa por 35 minutos a 37 graus Celsius. Tire a placa da incubadora.
Aspire suavemente as células desequilibrada. Lave uma vez com dPBS contendo 0,5% BSA e 0,7 mililitros de cálcio e magnésio. Lys as células aderentes adicionando 200 microliters de tampão de lise.
Ao mesmo tempo, prepare a curva padrão sobre uma a duas diluições seriais das células rotuladas no tampão de lise. Realize a leitura do sinal de floresnce no instrumento F 200 T-can infinito usando 544 nanômetros como comprimento de onda de excitação e 590 nanômetros como comprimento de onda de emissão. Resultados representativos.
Como mostrado pelos resultados representativos, é evidente que a adesão celular ao ácido hialurônico encontrou C1q como fortemente aprimorada em comparação com HA sozinho ou HA ligado BSA. A porcentagem de células aderentes em cada matriz é calculada com base na curva padrão. Conclusões. Em nossos experimentos, em primeiro lugar, avaliamos a capacidade do componente complementar C12 de ligar a matriz extracelular neste caso ácido hialurônico usando um metal arisal.
Em segundo lugar, analisamos a capacidade das células primárias humanas manchadas com corante fluorescente para perseguir ácido hialurônico ligado. O modelo que propusemos neste estudo é um método mais fácil e mais rápido e barato em alternativa ao modelo 3D de andaimes de matriz extracelular para avaliação nesta resposta celular a uma combinação de estímulos.
