هذه الطريقة بسيطة نسبيا وتسمح بالتحرير الجيني الفعال لخلايا المكاك البائية الريسوس. تسمح هذه الطريقة باختبار الخلايا البائية المحررة جينيا لأغراض علاجية في المكاك الريسوسية. كما أنها مناسبة لأبحاث العلاج بالخلايا البائية قبل السريرية.
يمكن تكييف الطريقة العامة لأنواع الخلايا الأخرى. إذا تم اتباع الإجراء بشكل صحيح ، فلا ينبغي للمرء أن يتوقع صراعات. ومع ذلك ، نظرا لأن كفاءة قطع gRNA ومجموعة جيدة الجودة من قالب توفير AAV6 المؤتلف أمر بالغ الأهمية.
للبدء ، قم بتسخين وسائط زراعة الخلايا البائية في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. قم بإذابة منشطات الخلايا البائية على الجليد. قم بإعداد أنبوب بحجم مناسب يحتوي على وسائط ذوبان تم تسخينها مسبقا.
قم بإذابة قارورة أو قنينتين من خلايا الطحال المكاك الريسوس الأولية أو PBMCs في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. صب الخلايا الطحالية في الأنبوب المحضر الذي يحتوي على وسط ذوبان تم تسخينه مسبقا. شطف cryotubes لجمع كل الخلايا.
أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 غرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 10 ملليلتر من وسط الذوبان للغسيل. كرر عمليات الطرد المركزي ثلاث مرات لإزالة وسط التجمد.
بعد الطرد المركزي الأخير ، أعد تعليق الخلايا عند ما يقدر بخمسة في 10 إلى ست خلايا لكل ملليلتر في وسط زراعة الخلايا البائية. الجمع بين 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من 0.4 ٪ تريبان الأزرق وعد الخلايا على مقياس الدم. اضبط تركيز الخلية على ثلاث مرات 10 إلى ست خلايا لكل مليلتر باستخدام وسط زراعة الخلايا البائية وفقا لعدد الخلايا.
ثم أضيفي منشطات الخلايا البائية إلى تركيزاتها النهائية واخلطيها. نقل الخلايا إلى طبق زراعة الخلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. بعد الاستقرار ، يجب أن تشكل الخلايا طبقة أحادية كثيفة وقد تكون مجموعات صغيرة من الخلايا مرئية بالفعل.
بعد حوالي يومين ، يجب أن تكون الخلايا صحية وغير منتظمة وشكلت مجموعات أكبر بشكل واضح. بعد تنشيط الخلايا البائية ، قم بإعداد الكواشف للتثقيب الكهربائي والتنبيث. المخزن المؤقت المزدوج الخالي من النوكلياز DMSO ، والمخزن المؤقت T ، والمخزن المؤقت E أو E2 من مجموعة التثقيب الكهربائي إلى درجة حرارة الغرفة.
قم بإذابة قالب الإصلاح الموجه بالتماثل rAAV6 ، أو HDRT ، ومنشطات الخلايا البائية على الجليد. أعد تعليق الحمض النووي الريبي أحادي التوجيه CRISPR Cas9 ، أو sgRNA ، عند 100 ميكرومولار في المخزن المؤقت المزدوج. يعاد تكوينه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ويخلط عن طريق الدوامة والنقر.
ضع sgRNA المعاد تشكيله على الثلج حتى الاستخدام. للتثقيب الكهربائي 10 ميكرولتر ، قم بإعداد 550 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا البائية مع المنشطات و 1٪ DMSO. أضف 50 ميكرولترا من هذا الوسط مع أو بدون مضادات حيوية إلى لوحة زراعة خلايا 48 بئرا.
ثم أضف rAAV6 HDRT إلى الوسط في الآبار ، حتى 20٪ من حجم البئر. سخن الطبق المحضر والوسط المتبقي في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، من أجل التثقيب الكهربائي 10 ميكرولتر ، قم بإعداد 1.15 ميكرولتر من البروتين النووي الريبي ، أو RNP ، عن طريق خلط 0.4 ميكرولتر من 61 ميكرومولار Cas9 مع 0.75 ميكرولتر من sgRNA 100 ميكرومولار في مخزن مؤقت مزدوج.
احتضان RNP لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل خلطها مع الخلايا. بعد الحضانة ، يمكن الجمع بين RNPs متعددة إذا كان سيتم استهداف أكثر من موضع واحد في وقت واحد. بعد ذلك ، قم بإعداد الخلايا للتثقيب الكهربائي.
اترك الخلايا في درجة حرارة الغرفة لتجنب صدمات درجة الحرارة. بعد الحضانة ، احصد الخلايا في وعاء مناسب. شطف الطبق مع DPBS لجمع أكبر عدد ممكن من الخلايا.
أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 200 غرام لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في DPBS بمعدل مرتين تقريبا 10 إلى ست خلايا لكل مليلتر ، بناء على عدد الخلايا الموضوعة في الثقافة. الجمع بين أحجام متساوية من تعليق الخلية و 0.4 ٪ تريبان الأزرق والعد باستخدام مقياس الدم.
بعد الطرد المركزي والتخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا في المخزن المؤقت T الذي تم تسخينه مسبقا عند 5.55 مرات 10 إلى سبع خلايا لكل مليلتر ، بناء على عدد الخلايا. قم بإعداد نظام النقل عن طريق تشغيل الجهاز وضبطه على 1 ، 350 فولت ، 15 مللي ثانية ، ونبضة واحدة. ضع محطة الماصة داخل غطاء التدفق الصفحي.
لكل مجموعة من 10 ثقوب كهربائية ، قم بإعداد أنبوب نقل مع ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت E.أدخل الأنبوب في محطة الماصة. اجمع بين 1.15 ميكرولتر من RNP مع تسعة ميكرولتر من الخلايا لكل ثقب كهربائي. تحضير ما لا يقل عن 20 ٪ أكثر لتجنب الفقاعات واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة قبل التثقيب الكهربائي.
نضح 10 ميكرولتر من RNP وخليط الخلية في طرف التثقيب الكهربائي على ماصة التثقيب الكهربائي. أدخل الماصة المحملة في محطة الماصة وابدأ التثقيب الكهربائي. تأكد من خلو الأطراف تماما من فقاعات الهواء لمنع الانحناء.
أخرج الخلايا المكهربة على الفور إلى الحجم الصغير المعد مسبقا من الوسط ، مع أو بدون rAAV6 ، داخل البئر 48. إضافة عينات تحكم دون نقل إلى آبار الاستزراع. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة أربع إلى ست ساعات.
في نهاية الحضانة ، أضف 450 ميكرولترا من وسط زراعة الخلايا البائية الذي تم تسخينه مسبقا والذي يحتوي على المنشطات ، DMSO ، ومع أو بدون مضادات حيوية في اللوحة. إجراء تحليل الحمض النووي الجينومي بعد 24 ساعة. قم بقياس كفاءة التحرير باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل للقطرات الرقمية ، أو PCR ، باستخدام برايمر خارج ذراع التماثل وبرايمر داخل الإدخال.
قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم موقع الإدراج وتسلسل سانجر للتحقق من التحرير الصحيح. لتحليل مستويات البروتين ، قم بزراعة الخلايا لمدة 40 إلى 48 ساعة بعد التثقيب الكهربائي للسماح بتغيير تعبير البروتين وإجراء تحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي. أدى إنتاج rAAV6 باستخدام مساعد الفيروسة الغدية ذاتي الإسكات الذي يدعم التتراسيكلين إلى إنتاج أربعة أضعاف 10 إلى 10 GC لكل ملليلتر من وسط زراعة الخلايا ، متفوقا على الإنتاج باستخدام نقل ثلاثي خال من المساعد بمقدار 30 إلى 40 ضعفا.
أدى التنقية الاختيارية إلى القضاء على غالبية خلايا CD3 + T وخلايا CD14 + و CD16 + النخاعية ، مع نقاء 80 إلى 95٪ من خلايا CD20 + B التي يتم الحصول عليها بشكل روتيني. التحرير الجيني لخلايا المكاك البائية الريسوس الأولية موضحة هنا. حافظت هذه الدراسة على قابلية عالية للبقاء للخلية ، مع حذف تعبير سلسلة الضوء في 80٪ من الخلايا البائية في نفس الوقت.
لا تزال غالبية الخلايا البائية تعبر عن النمط المتماثل IgM. أدت إضافة rAAV6 التي تشفر الجسم المضاد 1485 HDRT إلى تحرير الجينات والتعبير السطحي للأجسام المضادة 1485 في 16 إلى 21٪ من الخلايا البائية ، وإن كان ذلك بكثافة مضان أقل لسلاسل الأجسام المضادة مقارنة بالخلايا البائية غير المحررة. أدت إضافة 1٪ DMSO والحضانات الموسعة والمركزة مع rAAV6 HDRT بشكل عام إلى زيادة كفاءة التحرير.
باستخدام هذه الطريقة ، عادة ما يتم تحقيق كفاءة تحرير من خمسة إلى 20٪ وما يصل إلى 40٪ ، اعتمادا على المكاك الريسوس الفردية وجودة دفعة rAAV6 HDRT. أثناء إجراء التثقيب الكهربائي ، تأكد من وجود مزيج كاف للتحويل وعدم وجود فقاعات في الحافة. يمكن تحليل الخلايا بأي طريقة مرغوبة أو يمكن إجراء نقل ذاتي إلى المكاك الريسوس المانحة.
