يحيط النسيج الشحمي الزّي المحيط بالأوعية الدموية وينظم فسيولوجيا القلب والأوعية الدموية. يستخدم هذا البروتوكول للإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بوظيفة السلف الدهنية البشرية في البيئة الدقيقة الوعائية. تختلف الخلايا السلف الدهنية وفقًا لموقعها التشريحي.
ونحن نظهر أن يمكن أن تستمد مجموعة من السلف متعددة القدرات بنجاح من الأنسجة الدهنية perivascular من المرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية. إثبات الإجراء سيكون سبنسر سكوت، طالب طب من مختبري. الحصول على قطعة 500 مليغرام من الأنسجة الدهنية Perivascular الإنسان أو PVAT من غرفة العمليات كما هو موضح في بروتوكول النص.
نقل PVAT الإنسان الطازجة من DMEM إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر تحتوي على 25 ملليلتر من محلول المضادات الحيوية. احتضان مع هزاز لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية. في حين أن PVAT هو في حل المضادات الحيوية، ذوبان aliquot من العازلة تفكك في 37 درجة مئوية.
إضافة 50 ميكرولترات من 100x المضادات الحيوية / محلول مضاد للوميكوليك إلى خمسة ملليلتر من العازلة الانفصام وتعقيم باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرون. إضافة ملليلتر واحد من محلول الجيلاتين إلى بئر واحد من لوحة 24-جيدا. في غطاء محرك تدفق المفارش، استخدم ملقط ومقصات معقمة لنقل PVAT من محلول المضادات الحيوية إلى طبق بيتري معقمة.
إضافة ملليلتر واحد من العازلة ما قبل الدافئة تفكك الأنسجة. ناعما ينم الأنسجة بأكملها في الطين باستخدام ملقط العقيمة ومقص تشريح. نقل الطين ملليلتر واحد إلى أربعة ملليلتر من العازلة الانفصام.
احتضان الأنبوب على جانبه في شاكر مداري درجة حرارة مسبقة 37 درجة مئوية عند 200 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة واحدة، لا ينبغي أن تكون هناك قطع الأنسجة مرئية، والحل سوف تظهر كـ تعليق خلية غائم. تصفية الحل من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون تعيين فوق أنبوب مخروطي 50 ملليلتر.
شطف المصفاة مع 10 ملليلتر إضافية من محلول المضادات الحيوية لالتقاط أكبر عدد ممكن من الخلايا. لا تضغط على مصفاة. الآن بيليه الخلايا لمدة 12 دقيقة في 300 مرة ز في جهاز طرد مركزي دلو يتأرجح.
بعد الطرد المركزي، سيتم فصل الأنبوب إلى طبقة أعلى الدهنية من adipocytes، interphase و بيليه. بيليه هو كسر الأوعية الدموية stromal التي تحتوي على الخلايا البطانية, الخلايا المناعية, خلايا الدم والخلايا السلف. إعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من HBSS والطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 300 مرة ز.
كرر هذه الخطوة لمجموع اثنين من يغسل في HBSS. الآن يُفطّن الجيلاتين من طبق 24 بئراً. غسل بلطف البئر مرة واحدة مع HBSS لإزالة الجيلاتين غير منضم.
Resuspend الكسر الأوعية الدموية stromal بيليه مع خلايا الدم الحمراء سليمة في ملليلتر واحد من متوسطة النمو والبذور على الجيلاتين المغلفة جيدا. ثم إضافة FGF2 الإنسان إلى تركيز النهائي من 25 نانوغرام لكل ملليلتر في الثقافة المتوسطة. احتضان لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
بعد زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة، وإزالة وسائل الإعلام نمو وغسل الخلايا خمس مرات مع HBSS. هذه الخطوة غسل يزيل خلايا الدم الحمراء والخلايا الميتة. ثم إضافة ملليلتر واحد من وسائل الإعلام النمو الطازجة تكمل مع 25 نانوغرام لكل ملليلتر FGF2 إلى كل بئر.
تغيير وسائل الإعلام كل 48 ساعة مع التأكد من تكملة مع 25 نانوغرام لكل ملليلتر FGF2 الطازجة في كل مرة. مرور الخلايا بمجرد أن تصل إلى 100٪ التقاء سبعة إلى 10 أيام بعد explant. للقيام بذلك، الطامح وسائل الإعلام النمو وغسل monolayer مرتين مع HBSS ملليلتر واحد.
pirate كل HBSS من الآبار وإضافة بضع قطرات من حل تفكك الخلية. اضغط على لوحة ودوامة عدة مرات واحتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة خمس إلى سبع دقائق لرفع الخلايا. ثم إضافة ما يقرب من ملليلتر واحد من ثقافة جديدة المتوسطة إلى الخلايا المنفصلة.
توزيع 500 ميكرولترات من الخلايا المنفصلة على بئرين من لوحة 24 بئر يحتوي كل منها على 500 ميكرولترات من وسائط النمو و25 نانوغرام FGF2. أيضا، ثقافة الإنسان نخاع العظام Mesenchymal الخلايا الجذعية أو مستعمرات MSC كما هو موضح في بروتوكول النص. لوحة الأرقام المناسبة من نخاع العظام والخلايا المشتقة من PVAT في بئر من لوحة 12-جيدا.
لadipogenic والظروف العظمية، لوحة ما يقرب من 200، 000 إلى 225، 000 الخلايا في البئر. في حين للشروط chondrogenic، لوحة 150، 000 إلى 175، 000 الخلايا في البئر. ثم فصل الخلايا عن كل من الإنسان PVAT الخلية السلف والسكان البشري نخاع العظم MSC عن طريق إضافة حل مفرزة الخلية.
احتضان الخلايا في حل مفرزة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة خمس دقائق. سحب السكان في قوارير مخروطية منفصلة 15 ملليلتر. تدور قارورة أسفل في 500 مرات ز لمدة سبع دقائق ل بيليه الخلايا.
ثم إعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني واستخدام مقياس الدم لتقدير عدد الخلايا. لوحة الخلايا في أطباق 12 جيدا كما كان من قبل. تقديم أطباق منفصلة لظروف adipogenic والعظام المستحثة وغير المستحثة.
وإضافة 1.5 ملليلتر من وسائط الاتصال adipogenic والعظام إلى كل بئر من الحالة المستحثة. ثم إضافة 1.5 ملليلتر من وسائل الاعلام adipogenic والعظام غير التعريفي إلى كل بئر من الشرط غير المستحث. بدء حضانة مجموعات الخلايا المستحثة والمستحثة بالعظام والخلايا غير المستحثة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون.
تدور أسفل حجم المتبقية من الخلايا السلف PVAT الإنسان وMSCs نخاع العظام البشري لمدة سبع دقائق في 500 مرة ز. تحديد حجم اللازمة لإعادة تعليق نخاع العظام المتبقية والكريات الخلية المشتقة من PVAT لتحقيق كثافة 100،000 خلية لكل 10 ميكرولترات. ثم إعادة تعليق الكريات في الحجم المحسوب من وسائط النمو MSC لاستقراء النسب chondrogenic.
نقل بلطف حجم الخلايا صعودا وهبوطا باستخدام ماصة لضمان توزيع متجانسة. الآن ماصة 10 ميكرولتر قطرات من حل الخلية المركزة في مركز كل بئر لتشكيل كتلة صغيرة من 100، 000 الخلايا. ضع مليمتر واحد من الماء المعقم في البئر المجاورة لمنع التبخر.
احتضان الثقافات كتلة صغيرة لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 للسماح للكتلة الصغيرة لتجميع. بعد ساعتين، تضاف بعناية chondrogenic تمايز وسائل الإعلام ارتفعت مع 10 نانوغرام لكل ملليلتر الإنسان TGF-beta-one إلى كل من الآبار حالة المستحثة. الآن بعناية إضافة 1.5 ملليلتر من وسائل الإعلام غير التعريفي لآبار الشرط غير المستحث.
كشط أو صب كتلة صغيرة في حالة شوكندروجينية مستحثة في كاسيت من أجل التجفيف، تضمين، وصمة العينة كما هو موضح في بروتوكول النص. أجريت دراسات تمايز Adipogenic بالتوازي مع MSC المشتقة من نخاع العظم البشري وخلايا السلف المشتقة من PVAT. في حالة غير مستحث, لا تراكم الدهون واضح.
هذا على النقيض من الحالة المستحثة التي تظهر بعد تلطيخ الدهون المحايدة مع Oil Red O.While درجة التمايز في الخلايا المشتقة من PVAT الأبهري البشري أكثر قوة ، أظهرت مصادر الخلايا البشرية القدرة على التمييز للنسل الادبوي. تم استخدام بروتوكول التمايز العظمي لـ MSCs المشتقة من نخاع العظم البشري والخلايا المشتقة من PVAT. لم الخلايا غير المستحثة وصمة عار مع أليسارين الأحمر.
بعد بروتوكول التمايز العظمي ، وضعت MSCs الإنسان العقيدات المتكلسة التي تلطخت بال Alizarin Red في حين أن خلايا PVAT الأبهر البشري لم تفعل ذلك. الخلايا المشتقة من كل من MSCs نخاع العظام البشري وPVAT الإنسان عرض ميزات مميزة للتمايز chondrogenic مع تراكم الكولاجين وفيرة في كتلة صغيرة. يتم تشكيل كتلة صغيرة من MSCs نخاع العظام البشري والخلايا الأبهرية المشتقة PVAT أظهرت أيضا تراكم وفير من الجليكوسامينوغلوكان كما هو مبين من قبل تلطيخ الأزرق Alcian.
مورفولوجيا، تم الكشف عن هياكل مماثلة للثغرات مع الخلايا الجالسة في تجاويف محاطة ترسب الكولاجين. من الأهمية بمكان أن ينوم ناعما الأنسجة الدهنية perivascular قبل فصل الأنزيمية وضمان مطلية كثافات الخلايا المناسبة لكل قياس النسب التمايز. بعد هذا الإجراء، ينبغي استخدام PCR الكمي جنبا إلى جنب مع لطخة الغربية والتدفق الخلوي لتوصيف علامات النسب محددة من السلف المتباينة من الدهنية perivascular ومصادر نخاع العظام.
مع هذه التقنية، يمكننا أن نبدأ في فهم الآليات التي تنظم توسع الأنسجة الدهنية perivascular والخلل الوظيفي أثناء السمنة والآثار التي الخلايا السلف على وظيفة الأوعية الدموية وأمراض القلب والأوعية الدموية.
