بروتوكول لدينا تمكن رؤى فريدة من نوعها في آليات مستوى الأنسجة الجزيئية والجملة من vasculogenesis التي قد تساعد في هندسة vasculature وظيفية لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية في النمذجة. يسمح هذا البروتوكول بإنشاء شبكات الأوعية الدموية القوية ثلاثية الأبعاد لتقييم الإمكانات الوعائية لمختلف المنصات ، كما يوفر خط أنابيب حسابي مفتوح المصدر المجاني لتحليل طبولوجيا الشبكة النهائية. تبدأ بإضافة 250 ميكروليتريس من حل انفصال الخلية في بئر من ثقافة الخلية D5D6 متمايزة لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، استخدم نصيحة P1000 ماصة لفك الخلايا في تعليق خلية واحدة. تجمع حلول الخلية في أنبوب مخروطي واحد 15 ملليلتر للطرد المركزي. نحن تعليق بيليه في 200 ميكرولترات من الجليد الباردة فرز العازلة وتسمية الخلايا مع خمسة microliters من الأجسام المضادة CD34 مترافق الفلوروستين المركزة لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية.
في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا في خمسة mililitres من الجليد الباردة فرز العازلة. تصفية التعليق من خلال 40 ميكرومتر صب مصفاة في خمس ملليلتر الفلوريسنس تنشيط فرز الخلايا، أو FACS، أنبوب. قبل تشغيل العينة، فرز مرة واحدة 10 من الخلايا غير المصنفة الرابعة على مقياس النسل، يسور منطقة في شدة الفلوريسين عالية التي لا تحتوي على أي من الخلايا غير المصنفة لتكون بمثابة عنصر تحكم سلبي.
ثم فرز العينة المسماة تحتوي على السلف البطانية المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات استناداً إلى تعبيرها CD34 عالية. في نهاية هذا النوع، نقل الخلايا السلف البطانية إلى أنبوب microcentrifuge للطرد المركزي. لكولاجين التغليف الهيدروجيل من الخلايا السلف، ونحن تعليق بيليه الخلية فرزها في 200 ميكرولتر من النمو Endothelial المتوسطة 2، تستكمل مع 10 ميكروميلتر من المانع روك Y-27632.
إضافة الخلايا إلى 400 ميكرولترات من متوسطة البذر في أنبوب microcentrifuge 1.8 mililiter على الجليد. مزيج 350 ميكرولترات من الكولاجين في تعليق الخلية. الحل سيصبح أصفر شاحب.
بعد ذلك، اخلط عشرة ميكرولترات من هيدروكسيد الصوديوم 1-مولر في محلول الكولاجين والخلايا. الحل سيصبح الآن وردي مشرق. Pipette 56 ميكرولترات من هذا حل خلية الكولاجين تحييد في الآبار الفردية من 96 جيدا مرفق منخفضة جدا U-القاع خلية لوحة الثقافة لاحتضان 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، فحص الآبار تحت المجهر الميداني مشرق للتأكد من أن الخلايا قد تم توزيعها بالتساوي. ثم إضافة 100 ميكرولتررس من النمو Endothelial إعدادها حديثا متوسط 2، تستكمل مع المانع روك وعائي عامل النمو البطانية لكل بئر والعودة لوحة إلى الحاضنة 37 درجة مئوية. بعد أسبوع واحد من الثقافة، إضافة 250 ميكرولترات من 4٪ شبهformaldehyde إلى بئر واحد من 48 لوحة جيدا لكل هيدروجيل وإزالة المتوسطة من الهيدروجيل.
ثم استخدم ملاقط ذات رؤوس دقيقة لنقل الهيدروجيل إلى شبه شكلي يحتوي على آبار. بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وغسل بسرعة الهيدروجيل مع برنامج تلفزيوني و permeabilize الثقافات ثلاثية الأبعاد مع 250 ميكرولترات من 0.5٪ غير الأيونية السطحي لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الهيدروجيل مع اثنين من غسل خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع 250 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني، وتستكمل مع 300 ملليلتر الجليسين في الغسيل، تليها الغمر من كل هيدروجيل في 250 ميكرولترات من العازلة سد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تسمية الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة المخففة في عازلة سد بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية, تليها اثنين من يغسل في 0.5٪ مستحلب الكاشف وبرنامج تلفزيوني دولبيككو. بعد الغسيل الثاني، تسمية الخلايا مع الأنواع المناسبة الأجسام المضادة الثانوية محددة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء، قبل غسل الثقافات ثلاثية الأبعاد مرتين في 0.5٪ مستحلب الكاشف وبرنامج تلفزيوني دولبيكو، كما هو موضح. لتصور نواة الخلية، إضافة DAPI، مخففة في تركيز واحد إلى 10000 في برنامج تلفزيوني للعينات لاحتضان لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، تليها اثنين من يغسل في 0.5٪ مستحلب كاشف وبرنامج تلفزيوني دولبيكو.
ثم استخدم ملاقط ذات رؤوس دقيقة لنقل كل عينة إلى وعاء عرض مناسب. بعد التمايز والفرز والتغليف في هيدروجيلات الكولاجين، والخلايا عادة ما تبقى مقربة لمدة 24 ساعة، قبل البدء في الهجرة وتشكيل التجويف الأولي. بعد حوالي ستة أيام من الثقافة ، ستكون الضفيرة الشعرية البدائية مرئية في الهيدروجيل عندما ينظر إليها مع المجهر الميدانية الزاهية.
بعد تصوير الهيدروجيلات الثابتة والملطخة والمثقلة بالخلايا على مجهر confocal ، يتم تحويل الصور المعالجة مسبقًا إلى هيكل عظمي يمكّن من تحليل الطول الإجمالي والاتصال بالشبكة. من الضروري إضافة المضادات الحيوية بعد FACS ، حيث يصعب تعقيم الجزء الداخلي من هذا الجهاز ، وإزالة المضادات الحيوية بعد 24 ساعة من تغليف الخلايا. باستخدام هذه التقنية، تمكنا من تحديد الخصائص الفيزيائية والكيميائية التي تحاكي المصفوفة غير الخلوية المواد الحيوية التي تتحكم في الإمكانات الوعائية للنسل endothelial المشتقة من iPSC.
