우리의 프로토콜은 모델링에서 심혈관 질환 치료를 위한 엔지니어링 기능적 혈관치료에 도움이 될 수 있는 혈관 신생의 분자 및 벌크 조직 수준 메커니즘에 대한 독특한 통찰력을 가능하게 합니다. 이 프로토콜을 사용하면 다양한 플랫폼의 혈관 전위평가를 위한 강력한 3차원 혈관 네트워크를 생성할 수 있으며 최종 네트워크 토폴로지 분석을 위한 무료 오픈 소스 계산 파이프라인도 제공합니다. D5D6 분화 세포 배양의 웰 당 250 마이크로 리터의 세포 분리 용액을 섭씨 37도에서 10 분 동안 첨가하여 시작합니다.
인큐베이션의 끝에서 P1000 파이펫 팁을 사용하여 세포를 단일 셀 현탁액으로 해리시합니다. 원심분리를 위해 단일 15 밀리리터 원판 튜브에 셀 솔루션을 풀. 우리는 얼음 냉기 선별 완충제 200 마이크로 리터에서 펠릿을 중단하고 4섭씨에서 10 분 동안 농축 형광 컨쥬게이징 CD34 항체의 5 마이크로 리터로 세포를 라벨.
인큐베이션이 끝나면 얼음 냉기 선별 버퍼의 5 밀리리터로 세포를 씻으라. 40 마이크로미터를 통해 서스펜션을 5밀리리터 형광 활성화 셀 정렬 또는 FACS 튜브에 붓는다. 시료를 실행하기 전에, 플루오시토미터에 네 번째 레이블이 없는 세포의 10배를 정렬하고, 음의 대조군으로 작용하기 위해 표지되지 않은 세포를 포함하지 않는 높은 형광 강도로 영역을 게이팅한다.
그런 다음 표지된 시료를 정렬하여 높은 CD34 발현에 기초하여 유도된 다능성 줄기 세포로부터 유래된 내피 전구체를 함유한다. 종류의 끝에서, 원심 분리를 위한 미세원심분리기 관으로 내피 전구 세포를 이송한다. 전구 세포의 콜라겐 하이드로겔 캡슐화의 경우, 우리는 내피 성장 중간 2의 200 마이크로 리터에서 정렬 된 세포 펠릿을 일시 중단, 로크 억제제 Y-27632의 10 마이크로 밀리터로 보충.
얼음 위에 1.8 밀리터 미세 원심 분리기 튜브에 파종 배지의 400 마이크로 리터에 세포를 추가합니다. 콜라겐 350마이크로리터를 세포 현탁액에 섞는다. 용액은 옅은 노란색이 될 것입니다.
다음으로, 1-뮬러 나트륨의 10 마이크로리터를 콜라겐 과 세포 용액에 섞는다. 이제 솔루션이 밝은 분홍색이 됩니다. 파이펫 56 마이크로리터는 이 중화 콜라겐 세포 용액을 96°C의 개별 우물로 미세화하여 섭씨 37도에서 30분 동안 배양할 수 있도록 매우 낮은 부착 U-바닥 세포 배양 플레이트를 제공합니다.
인큐베이션의 끝에서, 세포가 균등하게 분포되었는지 확인하기 위해 밝은 필드 현미경의 밑에 우물을 검사합니다. 그런 다음 새로 준비된 내피 성장 매체 2의 100 마이크로리터를 추가하여 ROCK 억제제와 혈관 내피 성장 인자로 보충하여 각 웰에 접시를 37도 섭씨 인큐베이터로 되돌릴 수 있습니다. 문화의 1 주일 후, 하이드로겔 당 48 웰 플레이트의 한 우물에 4 %의 파라 포름알데히드의 250 마이크로 리터를 추가하고 하이드로 겔에서 매체를 제거합니다.
그런 다음 미세 기울어진 핀셋을 사용하여 하이드로겔을 우물을 포함하는 파라포름데히드로 옮기습니다. 실온에서 10분 후, PBS로 하이드로겔을 빠르게 세척하고 실온에서 5분 동안 250마이크로리터의 이온성 계면활성제를 250마이크로리터로 투과화한다. 실온에서 25분 세척으로 하이드로겔을 250마이크로리터의 PBS로 세척하고, 각 하이드로겔을 실온에서 30분 동안 블로킹 버퍼 250마이크로리터에 담그게 됩니다.
적절한 1 차 항체가 하룻밤 동안 완충액을 차단하는 데 희석된 적절한 1차 항체로 세포에 라벨을 붙이고, 그 다음으로 0.5%의 유화 시약및 덜벡코의 PBS에서 2개의 세차체가 뒤따릅니다. 두 번째 세척 후, 3D 배양을 0.5%에 2회 세척하기 전에, 빛으로부터 보호되는 실온에서 2시간 동안 적절한 종 특이적 이차 항체로 세포를 라벨로 표시한 후, 입증된 바와 같이, 0.5%의 유화제 시약및 덜벡코의 PBS에서 두 번 세척한다. 세포 핵을 시각화하려면, 실온에서 2분 동안 PBS에 1~10000 농도로 희석된 DAPI를 추가한 다음 0.5%에 달하는 시약과 덜벡코의 PBS에 2개의 세척을 한다.
그런 다음 미세 기울어진 핀셋을 사용하여 각 샘플을 적절한 보기 용기로 옮기습니다. 콜라겐 하이드로겔에서 분화, 정렬 및 캡슐화 후, 세포는 일반적으로 24시간 동안 반올림된 상태로 유지되며, 초기 루멘을 형성하기 시작한다. 문화의 약 6 일 후에, 밝은 필드 현미경으로 볼 때 원시 모세관 신경총은 하이드로겔에서 볼 수 있을 것입니다.
공초점 현미경에 고정, 염색된, 세포 라덴 하이드로겔을 이미징한 후, 미리 처리된 이미지는 네트워크의 전체 길이 및 연결을 분석할 수 있는 골격으로 변환됩니다. 이 기구의 내부를 살균하는 것은 어렵기 때문에 FACS 후에 항생제를 추가하고 세포 캡슐화 후에 24 시간 항생제를 제거하는 것이 필수적입니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 생체 물질을 모방하는 세포외 매트릭스가 iPSC 유래 내피 세포 전구체의 혈관 수막 전위를 지배하는 물리적 및 화학적 특성을 결정할 수 있었습니다.
