Unser Protokoll ermöglicht einzigartige Einblicke in die molekularen und Massengewebe-Level-Mechanismen der Vaskulogenese, die bei der technischen funktionellen Vaskulatur für die Therapie von Herz-Kreislauf-Erkrankungen bei der Modellierung helfen können. Dieses Protokoll ermöglicht die Schaffung robuster, dreidimensionaler Gefäßnetzwerke zur Bewertung des vaskulogenen Potenzials verschiedener Plattformen und bietet auch eine kostenlose, Open-Source-Rechenpipeline für die Analyse der endgültigen Netzwerktopologie. Beginnen Sie mit 250 Mikroliter Zellablösung pro Bohrung der D5D6 differenzierten Zellkultur für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius.
Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine P1000 Pipettenspitze, um die Zellen in einzellige Suspensionen zu dissoziieren. Bündeln Sie die Zelllösungen in einem einzigen 15 Milliliter konischen Rohr für die Zentrifugation. Wir setzen das Pellet in 200 Mikrolitere eiskaltes Sortierpuffer aus und beschriften die Zellen mit fünf Mikrolitern konzentrierter Fluoreszenz konjugierter CD34-Antikörper für 10 Minuten bei vier Grad Celsius.
Am Ende der Inkubation die Zellen in fünf Millilitere eiskalte sortierende Puffer waschen. Filtern Sie die Suspension durch ein 40 Mikrometer gegossenes Sieb in ein fünf Milliliter Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieroder oder FACS-Rohr. Vor dem Ausführen der Probe ein mal 10. der vierten nicht beschrifteten Zellen auf dem Fluocitometer sortieren, einen Bereich mit einer hohen Fluoreszenzintensität, die keine der nicht beschrifteten Zellen enthält, um als negative Kontrolle zu dienen.
Sortieren Sie dann die beschriftete Probe enthalten endotheliale Vorläufer, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen auf der Grundlage ihrer hohen CD34-Expression abgeleitet wurden. Am Ende der Sortierung die endotheliale Vorläuferzellen zur Zentrifugation in ein Mikrozentrifugenrohr übertragen. Für die Kollagen-Hydrogelverkapselung der Vorläuferzellen setzen wir das sortierte Zellpellet in 200 Mikroliteren Endotheliaal Growth Medium 2 aus, ergänzt durch 10 Mikroliter des ROCK-Hemmers Y-27632.
Fügen Sie die Zellen zu 400 Mikrolitern Sämedium in einem 1,8-Milliliter Mikrozentrifugenrohr auf Eis hinzu. Mischen Sie 350 Mikroliter Kollagen in die Zellsuspension. Die Lösung wird blassgelb.
Als nächstes mischen Sie zehn Mikroliter 1-Muller Natriumhydroxid in die Kollagen- und Zelllösung. Die Lösung wird nun leuchtend rosa. Pipette 56 Mikroliter dieser neutralisierten Kollagenzelllösung in einzelne Brunnen einer 96 gut ultra-niedrigen Befestigung U-Boden-Zellkulturplatte für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius.
Am Ende der Inkubation untersuchen Sie die Brunnen unter einem hellfeldmikroskop, um zu überprüfen, ob die Zellen gleichmäßig verteilt wurden. Dann fügen Sie 100 Mikroliter frisch zubereiteten Endotheliaal Growth Medium 2, ergänzt mit ROCK Inhibitor und Vascular Endothelial Growth Factor, zu jedem Brunnen und geben Sie die Platte auf den 37 Grad Celsius Inkubator zurück. Nach einer Woche Kultur 250 Mikroliter 4%Paraformaldehyd in einen Brunnen einer 48-Well-Platte pro Hydrogel geben und das Medium aus den Hydrogelen entfernen.
Dann verwenden Sie eine feingekippte Pinzette, um die Hydrogele auf die paraformaldehydhaltigen Brunnen zu übertragen. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur die Hydrogele schnell mit PBS waschen und die 3D-Kulturen mit 250 Mikrolitern eines 0,5% nichtionischen Tensids bei Raumtemperatur fünf Minuten lang durchdringen. Waschen Sie die Hydrogele mit zwei fünfminütigen Waschungen bei Raumtemperatur mit 250 Mikroliter PBS, ergänzt mit 300 Milliliter Glycin pro Waschgang, gefolgt vom Eintauchen jedes Hydrogels in 250 Mikroliter Sperrpuffer für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
Beschriften Sie die Zellen mit den entsprechenden primärantikörpern, die über Nacht bei vier Grad Celsius im Blockierpuffer verdünnt werden, gefolgt von zwei Waschungen in 0,5% emulgierendem Reagenz und Dulbeccos PBS. Nach der zweiten Wäsche die Zellen zwei Stunden lang bei Lichtschutz mit dem entsprechenden artspezifischen Sekundärantikörper kennzeichnen, bevor Sie die 3D-Kulturen zweimal in 0,5% emulgierendem Reagenz und Dulbeccos PBS waschen, wie gezeigt. Um die Zellkerne zu visualisieren, fügen Sie DAPI hinzu, die mit einer Konzentration von 1 bis 10000 in PBS zu den Proben für eine zweiminütige Inkubation bei Raumtemperatur verdünnt wird, gefolgt von zwei Waschungen in 0,5% emulgierendem Reagenz und Dulbeccos PBS.
Verwenden Sie dann eine feingekippte Pinzette, um jede Probe auf ein geeignetes Sichtgefäß zu übertragen. Nach Differenzierung, Sortierung und Verkapselung in Kollagenhydrogelen bleiben die Zellen in der Regel 24 Stunden lang gerundet, bevor sie zu migrieren beginnen und erste Lumen bilden. Nach etwa sechs Tagen Kultur wird ein primitiver Kapillarplexus im Hydrogel sichtbar sein, wenn er mit heller Feldmikroskopie betrachtet wird.
Nach der Abbildung der fixierten, gefärbten, zellbeladenen Hydrogele auf einem konfokalen Mikroskop werden die vorverarbeiteten Bilder in ein Skelett umgewandelt, das eine Analyse der Gesamtlänge und Konnektivität des Netzwerks ermöglicht. Es ist zwingend notwendig, Antibiotika nach FACS hinzuzufügen, da die Sterilisation des Inneren dieses Instruments schwierig ist, und die Antibiotika 24 Stunden nach der Zellverkapselung zu entfernen. Mit dieser Technik konnten wir bestimmen, welche physikalischen und chemischen Eigenschaften extrazelluläre Matrix imitiert Biomaterialien das vaskulogene Potenzial von iPSC-abgeleiteten endotheliale Vorläufern iPSC-abgeleiteten Vorläufern steuern.
