我们的协议使独特的洞察血管生成分子和散装组织水平机制，可能有助于工程功能血管心血管疾病治疗建模。该协议允许创建强大的三维血管网络，用于评估各种平台的血管生成潜力，并提供一个免费的开源计算管道，用于分析最终的网络拓扑。首先，D5D6 分化细胞培养井每井添加 250 微升细胞分离溶液，在 37 摄氏度下 10 分钟。
在孵育结束时，使用P1000移液器尖端将细胞分离成单细胞悬浮液。将细胞溶液汇集在单个 15 毫升锥形管中，用于离心。我们悬浮在200微升冰冷分拣缓冲液中的颗粒，并在4摄氏度下用5微升浓缩荧光结合CD34抗体标记细胞10分钟。
在孵育结束时，用五升冰冷分拣缓冲液清洗细胞。通过 40 微米浇注滤网将悬浮液过滤到 5 毫升荧光激活细胞分拣或 FACS 管中。在运行样品之前，对荧光计上第四个未标记的细胞的十分之一进行排序，以荧光强度高、不包含任何未标记的细胞作为负对照区。
然后对标记的样本进行排序，其中包含基于高CD34表达的诱导多能干细胞的内皮祖细胞。在排序结束时，将内皮祖细胞转移到微离心管进行离心。对于祖细胞的胶原蛋白水凝胶封装，我们悬浮在内皮生长介质2的200微升中，并辅以10微牛奶的 ROCK 抑制剂Y-27632。
在冰上1.8英里微离心管中，将细胞加入400微升播种介质。将350微升胶原蛋白混合到细胞悬浮液中。溶液将变成淡黄色。
接下来，将1-Muller氢氧化钠的10微升混合到胶原蛋白和细胞溶液中。解决方案现在将变为明亮的粉红色。这种中和胶原蛋白细胞溶液的移液 56 微升到 96 孔超低附着 U 型细胞培养板的单个孔中，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。
在孵育结束时，在明亮的田间显微镜下检查孔，检查细胞的分布不均匀。然后添加100微升新鲜准备的内皮生长介质2，辅以 ROCK抑制剂和血管内皮生长因子到每一个井，并返回板到37摄氏度的培养箱。培养一周后，将250微升4%的甲醛加入每块水凝胶48井板的一个井中，然后从水凝胶中去除介质。
然后使用细尖的钳子将水凝胶转移到含有甲醛的井中。在室温下10分钟后，用PBS快速清洗水凝胶，并在室温下用250微升0.5%非离子表面活性剂渗透3-D培养物5分钟。在室温下用250微升PBS洗涤水凝胶，每次洗涤300毫升甘氨酸，然后将每个水凝胶浸入250微升的阻尼缓冲液中，在室温下浸泡30分钟。
在4摄氏度下用适当的原抗体在阻断缓冲液中稀释，随后在0.5%乳化试剂和Dulbecco的PBS中洗两次。第二次洗涤后，在室温下用适当的二级抗体标记细胞两小时，防止光线，然后用0.5%乳化试剂和Dulbecco的PBS两次清洗3D培养物，如证明。要可视化细胞核，请添加DAPI，在PBS中以1至10000浓度稀释，在室温下孵育两分钟，随后在0.5%乳化试剂和Dulbecco的PBS中进行两次洗涤。
然后使用细尖的钳子将每个样品转移到适当的观察容器中。在胶原蛋白水凝胶中分化、分拣和封装后，细胞通常会保持圆周24小时，然后开始迁移并形成初始流明。经过大约六天的培养后，用明亮的磁场显微镜看，在水凝胶中就会看到原始的毛细管丛。
在共体显微镜上对固定、染色、细胞载重水凝胶进行成像后，预处理的图像将转换为骨架，从而能够分析网络的整体长度和连通性。在 FACS 之后添加抗生素势在必行，因为对本仪器内部进行消毒很困难，并且在细胞封装后 24 小时取出抗生素。利用这项技术，我们能够确定哪些物理和化学特征的细胞外基质模仿生物材料控制 iPSC 衍生的衍生内皮祖细胞的血管生成潜力。
