Protokolümüz, modellemede kardiyovasküler hastalık tedavisi için mühendislik fonksiyonel vaskülatür yardımcı olabilecek vaskülogenezmoleküler ve toplu doku düzeyi mekanizmaları benzersiz anlayışlar sağlar. Bu protokol, çeşitli platformların vaskülojenik potansiyelini değerlendirmek için sağlam, üç boyutlu vasküler ağların oluşturulmasına olanak sağlar ve aynı zamanda nihai ağ topolojisini analiz etmek için ücretsiz, açık kaynak hesaplamalı bir boru hattı sağlar. D5D6 farklılaşmış hücre kültürünün kuyubaşına 250 mikrolitre hücre ayırma çözeltisi ekleyerek 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca başlayın.
Kuluçka sonunda, hücreleri tek hücresüspansiyonlarına ayırmak için P1000 pipet ucu kullanın. Santrifüj için hücre çözümlerini tek bir 15 mililitrelik konik tüpte birleştirin. Biz buz soğuk sıralama tampon 200 mikrolitre pelet askıya ve konsantre floresan beş mikrolitre ile hücreleri etiket CD34 antikor 10 dakika boyunca dört derece santigrat.
Kuluçka sonunda, hücreleri beş mililitre buz gibi soğuk sıralama tamponu içinde yıkayın. Filtre süspansiyon 40 mikrometre ile beş mililitre floresan aktif hücre sıralama içine süzgeç dökün, veya FACS, tüp. Örneği çalıştırmadan önce, negatif denetim olarak hizmet vermek için etiketlenmemiş hücrelerin hiçbirini içermeyen yüksek floresan yoğunluğunda bir bölgeyi gating, dördüncü etiketlenmemiş hücrelerin 10'da birini sıralayın.
Daha sonra etiketli örneği yüksek CD34 ekspresyonuna göre indüklenen pluripotent kök hücrelerden elde edilen endotel ataları içerir. Sıralamanın sonunda, endotel atahücreleri santrifüj için bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Projen hücrelerinkolajen hidrojel kapsüllemesi için, 200 mikrolitre Endotelyal Büyüme Orta 2, ROCK Inhibitörü Y-27632 10 mikromiliter ile desteklenen sıralanmış hücre pelet askıya.
Hücreleri buz üzerinde 1,8 mililitrelik mikrosentrifüge tüp içinde tohumlama orta 400 mikrolitre ekleyin. Hücre süspansiyon içine kollajen 350 mikrolitre karıştırın. Çözüm soluk sarı olacak.
Sonra, kollajen ve hücre çözeltisi içine 1-Muller sodyum hidroksit on mikrolitre karıştırın. Çözüm şimdi parlak pembe olacak. Pipet 56 mikrolitre bu nötralize kollajen hücre çözeltisi bireysel kuyular içine 96 iyi ultra-düşük eki U-alt hücre kültür plakası 37 santigrat derece de 30 dakikalık kuluçka için.
Kuluçka sonunda, hücrelerin eşit olarak dağıtıldığını kontrol etmek için parlak bir alan mikroskobu altında kuyuları inceleyin. Sonra taze hazırlanmış Endotel Büyüme Orta 100 mikrolitre ekleyin 2, ROCK Inhibitörü ve Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü ile desteklenen her iyi ve 37 derece Santigrat inkübatör plaka dönmek. Kültür bir hafta sonra, hidrojel başına 48 kuyu plaka bir kuyuya% 4 paraformaldehit 250 mikrolitre ekleyin ve hidrojeller orta kaldırın.
Sonra kuyular içeren paraformaldehit hidrojelleri aktarmak için ince uçlu cımbız kullanın. Oda sıcaklığında 10 dakika sonra hidrojelleri PBS ile hızla yıkayın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca %0,5 iyonik olmayan yüzey aktif maddenin 250 mikrolitresi ile 3-B kültürleri permeabilize edin. Hidrojelleri oda sıcaklığında 250 mikrolitre PBS ile iki beş dakikalık yıkama ile yıkayın, yıkama başına 300 mililitre glisin ile desteklenir, ardından her hidrojelin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 250 mikrolitre bloke tamponunun daldırmasını takip edin.
Hücreleri, tamponu bir gecede dört santigrat derece yle seyrelterek seyreltilmiş uygun birincil antikorlarla etiketle, bunu %0,5 emülsifiye reaktifinde ve Dulbecco'nun PBS'sinde iki yıkAma takip edin. İkinci yıkamadan sonra, 3-B kültürleri %0,5 emülsifiye reaktif ve Dulbecco'nun PBS'inde iki kez yıkamadan önce, hücreleri ışıktan korunan oda sıcaklığında iki saat boyunca uygun türlere özgü ikincil antikorla etiketlayın. Hücre çekirdeklerini görselleştirmek için, ODA sıcaklığında iki dakikalık kuluçka için PBS'de 1 ila 10000 konsantrasyonda seyreltilmiş DAPI'yi ekleyin, ardından %0,5 emülsifiye reaktifve Dulbecco'nun PBS'sinde iki yıkar.
Daha sonra her numuneyi uygun bir izleme kabına aktarmak için ince uçlu cımbız kullanın. Kollajen hidrojellerde farklılaşma, sıralama ve kapsüllemeden sonra, hücreler genellikle 24 saat boyunca yuvarlak kalır, göç ve ilk lümenler oluşturmadan önce. Kültür yaklaşık altı gün sonra, ilkel bir kılcal pleksus parlak alan mikroskobu ile bakıldığında hidrojel görünür olacaktır.
Bir konfokal mikroskop üzerinde sabit, lekeli, hücre yüklü hidrojeller görüntülendikten sonra, önceden işlenmiş görüntüler, ağın toplam uzunluğu ve bağlantısının analizini sağlayan bir iskelete dönüştürülür. Bu cihazın iç sterilizasyon zordur gibi, FACS sonra antibiyotik eklemek için zorunludur, ve hücre kapsülleme sonra antibiyotikler kaldırmak için 24 saat. Bu tekniği kullanarak, iPSC kaynaklı endotel atalarının vaskülojenik potansiyelini biyomateryalleri taklit eden hücre dışı matriksin hangi fiziksel ve kimyasal özelliklerini yönettiğini belirleyebildik.
