当社のプロトコルは、血管系疾患治療の機能的な血管系の工学的な機能性をモデリングに役立つ血管新生の分子およびバルク組織レベルのメカニズムに対するユニークな洞察を可能にします。このプロトコルは、様々なプラットフォームの脈管原性ポテンシャルを評価するための堅牢な3次元血管ネットワークの作成を可能にし、また、最終的なネットワークトポロジを分析するための無料のオープンソース計算パイプラインを提供する。まず、摂氏37度で10分間、D5D6分化細胞培養の井戸当たり250マイクロリットルの細胞剥離液を添加します。
インキュベーションの終了時に、P1000ピペットチップを使用して細胞を単一細胞懸濁液に解約する。遠心分離のための単一の15ミリリットルの円錐管の細胞の解決をプールする。ペレットを氷冷選別バッファーの200マイクロリットルに吊り下げ、5マイクロリットルの濃縮蛍光結合CD34抗体を摂氏4度で10分間標識します。
インキュベーションの終わりに、5ミリリットルの氷冷選別バッファーで細胞を洗浄する。40マイクロメートルを通して懸濁液をフィルターし、5ミリリットルの蛍光活性化細胞選別、またはFACSチューブにストレーナーを注ぎます。サンプルを実行する前に、フルオシトメーター上の4番目の非標識細胞の10分の1を並べ替え、負のコントロールとして機能する非標識細胞のいずれも含まない高い蛍光強度で領域を測定する。
次に、標識されたサンプルを並べ替え、それらの高いCD34発現に基づいて誘導多能性幹細胞に由来する内皮前駆体を含む。種類の終わりに、遠心分離のために内皮前駆細胞をマイクロ遠心分離管に移す。前駆細胞のコラーゲンヒドロゲルカプセル化については、細胞ペレットを200マイクロリットルの内皮成長培地2に懸濁し、ROCK阻害剤Y-27632の10ミクロリットルを添加した。
氷の上の1.8ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに播種培地の400マイクロリットルに細胞を追加します。350マイクロリットルのコラーゲンを細胞懸濁液に混ぜます。溶液は淡い黄色になります。
次に、1-ミュラー水酸化ナトリウムの10マイクロリットルをコラーゲンと細胞溶液に混ぜます。ソリューションは今明るいピンクになります。この中和コラーゲン細胞溶液のピペット56マイクロリットルは、摂氏37度で30分間のインキュベーションのための96ウェル超低付着U-底細胞培養プレートの個々の井戸に。
インキュベーションの終わりに、明視野顕微鏡の下でウェルを調べて、細胞が均等に分布していることを確認します。その後、調製した新しい内皮成長培地2の100マイクロリットルを追加し、ROCK阻害剤と血管内皮成長因子を各ウェルに添加し、プレートを37°Cインキュベーターに戻します。培養の1週間後、ヒドロゲルあたり48ウェルプレートの1ウェルに4%パラホルムアルデヒドの250マイクロリットルを加え、ヒドロゲルから培地を取り除きます。
次に、細かいピンセットを使用して、ウェルを含むパラホルムアルデヒドにヒドロゲルを移します。室温で10分後、迅速にPBSでヒドロゲルを洗浄し、室温で5分間0.5%非イオン界面活性剤の250マイクロリットルで3D培養物を透過させます。室温で250マイクロリットルのPBSで2回の5分間の洗浄でヒドロゲルを洗浄し、1洗浄あたり300ミリリットルのグリシンを加え、続いて各ヒドロゲルを250マイクロリットルのブロッキングバッファーに浸漬して室温で30分間洗浄します。
適切な一次抗体を適切な一次抗体で希釈し、摂氏4度で一晩ブロッキングバッファーに希釈し、続いて0.5%乳化試薬とDulbeccoのPBSで2回のスケを行います。2回目の洗浄後、適切な種特異的二次抗体を用いて細胞に光から保護された室温で2時間標識し、3D培養物を0.5%乳化試薬およびダルベッコPBSで2回洗浄する前に、実例通り。細胞核を可視化するには、PBS中の1~10000濃度で希釈して室温で2分間培養し、続いて0.5%乳化試薬とダルベッッコPBSで2回の洗剤を加える。
次に、細かいピンセットを使用して、各サンプルを適切な観察容器に移します。コラーゲンヒドロゲルの分化、並べ替え、カプセル化の後、細胞は通常、移行し始めて初期の内腔を形成する前に、24時間丸められたままになります。約6日間の培養後、明るいフィールド顕微鏡で観察すると、原始的な毛細血管叢がヒドロゲルに見えるようになります。
コンフォーカル顕微鏡上で固定、染色、細胞を含んだヒドロゲルをイメージングした後、事前処理された画像は、ネットワークの全長および接続性の分析を可能にする骨格に変換される。FACSの後に抗生物質を添加することは、この器具の内部を殺菌することは困難であり、細胞カプセル化の24時間後に抗生物質を除去することが不可欠である。この技術を用いて、生体材料を模倣する細胞外マトリックスがiPSC由来の内皮前駆物質の血管原性ポテンシャルを支配する物理的および化学的特性を決定することができた。
