Nosso protocolo permite insights únicos sobre os mecanismos de nível de tecido molecular e a granel da vasculogênese que podem ajudar na vasculatura funcional de engenharia para a terapia de doenças cardiovasculares na modelagem. Este protocolo permite a criação de redes vasculares robustas e tridimensionais para avaliar o potencial vasculogênico de várias plataformas, e também fornece um pipeline computacional de código aberto gratuito para análise da topologia final da rede. Comece adicionando 250 microlitres de solução de descolamento celular por poço da cultura celular diferenciada D5D6 por 10 minutos a 37 graus Celsius.
No final da incubação, use uma ponta de pipeta P1000 para dissociar as células em suspensões de células únicas. Acumule as soluções celulares em um único tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação. Suspendemos a pelota em 200 microliters de tampão de classificação gelada e rotulamos as células com cinco microliters de fluorescência concentrada conjugado anticorpo CD34 por 10 minutos a quatro graus Celsius.
No final da incubação, lave as células em cinco mililitros de tampão de classificação gelada. Filtre a suspensão através de um filtro de 40 micrômetros em um tubo de célula ativada por fluorescência de cinco milímetros, ou FACS, tubo. Antes de executar a amostra, classifique uma vez 10 das quartas células não rotuladas no fluocitômetro, gating uma região com alta intensidade de fluorescência que não contém nenhuma das células não rotuladas para servir como controle negativo.
Em seguida, classifique a amostra rotulada contendo progenitores endoteliais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas com base em sua alta expressão CD34. No final do tipo, transfira as células progenitoras endoteliais para um tubo de microcentrifuuge para centrifugação. Para o encapsulamento de hidrogel de colágeno das células progenitoras, suspendemos a pelota de célula classificada em 200 microliters de Endotelial Growth Medium 2, suplementado com 10 micromiliter do Inibidor rock Y-27632.
Adicione as células a 400 microliters de meio de semeadura em um tubo de microcentrifus de microcentrilha de 1,8 mililiter no gelo. Misture 350 microliters de colágeno na suspensão celular. A solução ficará amarela pálida.
Em seguida, misture dez microlitadores de hidróxido de sódio 1-Muller na solução de colágeno e célula. A solução agora se tornará rosa brilhante. Pipeta 56 microliters desta solução de célula de colágeno neutralizada em poços individuais de uma placa de cultura de célula u de apego ultra-baixo de 96 para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius.
No final da incubação, examine os poços sob um microscópio de campo brilhante para verificar se as células foram distribuídas uniformemente. Em seguida, adicione 100 microliters de endotelial médio 2 recém-preparado, complementado com inibidor de ROCHA e Fator de Crescimento Endotelial Vascular para cada poço e devolva a placa à incubadora Celsius de 37 graus. Após uma semana de cultura, adicione 250 microlitadores de 4%paraformaldeído a um poço de 48 placas de poço por hidrogel e remova o meio dos hidrogéis.
Em seguida, use pinças de ponta fina para transferir os hidrogéis para o paraformaldeído contendo poços. Após 10 minutos em temperatura ambiente, lave rapidamente os hidrogéis com PBS e permeabilize as culturas 3D com 250 microliters de um surfactante não iônico de 0,5% por cinco minutos à temperatura ambiente. Lave os hidrogéis com duas lavagens de cinco minutos à temperatura ambiente com 250 microliters de PBS, complementados com 300 mililitros de glicina por lavagem, seguido pela imersão de cada hidrogel em 250 microliters de tampão de bloqueio por 30 minutos à temperatura ambiente.
Rotule as células com os anticorpos primários apropriados diluídos no bloqueio durante a noite a quatro graus Celsius, seguido por duas lavagens em reagente 0,5% emulsionante e PBS de Dulbecco. Após a segunda lavagem, rotule as células com o anticorpo secundário específico da espécie apropriada por duas horas à temperatura ambiente protegida da luz, antes de lavar as culturas 3D duas vezes em reagente emulsionante de 0,5% e pbs de Dulbecco, como demonstrado. Para visualizar os núcleos celulares, adicione DAPI, diluído a uma concentração de 1 a 10000 em PBS às amostras para uma incubação de dois minutos à temperatura ambiente, seguido por duas lavagens em reagente 0,5% emulsificante e PBS de Dulbecco.
Em seguida, use pinças de ponta fina para transferir cada amostra para um vaso de visualização apropriado. Após a diferenciação, classificação e encapsulamento em hidrogéis de colágeno, as células normalmente permanecerão arredondadas por 24 horas, antes de começar a migrar e formar lúmens iniciais. Após cerca de seis dias de cultura, um plexo capilar primitivo será visível no hidrogel quando visto com microscopia de campo brilhante.
Após a imagem dos hidrogéis fixos, manchados e carregados de células em um microscópio confocal, as imagens pré-processadas são convertidas em um esqueleto que permite uma análise do comprimento geral e conectividade da rede. É imprescindível adicionar antibióticos após o FACS, pois a esterilização do interior deste instrumento é difícil, e remover os antibióticos 24 horas após o encapsulamento celular. Utilizando esta técnica, pudemos determinar quais características físicas e químicas a matriz extracelular imitando biomateriais regem o potencial vasculogênico dos progenitores endoteliais derivados derivados do iPSC.
