הפרוטוקול שלנו מאפשר תובנות ייחודיות על מנגנוני רמת הרקמה המולקולרית והתפזורת של vasculogenesis שעשויים לסייע בכלי הדם התפקודיים ההנדסיים לטיפול במחלות לב וכלי דם במודלים. פרוטוקול זה מאפשר יצירת רשתות כלי דם תלת מימדיות חזקות להערכת הפוטנציאל האגרטלוגני של פלטפורמות שונות, וגם מספק צינור חישובי חופשי בקוד פתוח לניתוח טופולוגיית הרשת הסופית. התחל על ידי הוספת 250 microlitres של פתרון ניתוק תאים ל הבאר של תרבות התאים המובחנים D5D6 במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
בסוף הדגירה, השתמש בקצה פיפטה P1000 כדי לנתק את התאים לתוך מתלים של תא יחיד. בריכת פתרונות התא בצינור חרוט אחד 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה. אנחנו להשעות את גלולה ב 200 microliters של חיץ מיון קר קרח ולתייג את התאים עם חמישה microliters של נוגדן CD34 פלואורסצנטי מרוכז במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
בסוף הדגירה, לשטוף את התאים בחמישה mililitres של חיץ מיון קר קרח. לסנן את ההשעיה דרך 40 מיקרומטר לשפוך מסננת לתוך חמש מיליליטר פלואורסצנטיות מופעל מיון תאים, או FACS, צינור. לפני הפעלת המדגם, מיין פי 10 מהתאים הבלתי-חגורים הרביעיים על הפלוציטמטר, וגודר אזור בעוצמת פלואורסצנטיות גבוהה שאינה מכילה אף אחד מהתאים הבלתי מרוסנים שישמשו כשליטה שלילית.
לאחר מכן מיין את המדגם שכותרתו מכילים אביהם אנדותל נגזר תאי גזע pluripotent המושרה בהתבסס על ביטוי CD34 הגבוה שלהם. בסוף המיון, להעביר את התאים הקדמונים progenitor לצינור microcentrifuge עבור צנטריפוגה. עבור אנקפסולציה הידרוג'ל קולגן של התאים הצאצאים, אנו להשעות את גלולת התא ממוין ב 200 microliters של צמיחה אנדותל בינוני 2, בתוספת 10 מיקרומיליטר של מעכבי רוק Y-27632.
מוסיפים את התאים ל-400 מיקרוליטרים של מדיום זריעה בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.8 מיליליטר על קרח. מערבבים 350 מיקרוליטרים של קולגן לתוך ההשעיה התא. הפתרון יהפוך לצהוב חיוור.
לאחר מכן, מערבבים עשרה מיקרוליטרים של 1-מולר נתרן הידרוקסיד לתוך קולגן ותא פתרון. הפתרון יהפוך כעת לוורוד בוהק. פיפטה 56 microliters של פתרון זה תא קולגן מנוטרל לתוך בארות בודדות של 96 גם אולטרה נמוך מצורף U-התחתון תא תרבות צלחת עבור דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
בסוף הדגירה, לבחון את בארות תחת מיקרוסקופ שדה בהיר כדי לבדוק כי התאים חולקו באופן שווה. לאחר מכן להוסיף 100 microliters של צמיחה אנדותל טרי מוכן בינוני 2, בתוספת מעכבי רוק וגורם גדילה אנדותל כלי דם לכל באר ולהחזיר את הצלחת אינקובטור 37 מעלות צלזיוס. לאחר שבוע של תרבות, הוסיפו 250 מיקרוליטרים של 4% פרפורמלדהיד ל הבאר אחת של צלחת של 48 בארות להידרוגל והסירו את המדיום מההידרוגלים.
לאחר מכן השתמשו בטוונצ'רים עדינים כדי להעביר את ההידרוגלים לפרפורמלדהיד המכיל בארות. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, שטפו במהירות את ההידרוגלים עם PBS וחלחלו לתרבויות תלת-מיתיות עם 250 מיקרוליטרים של חומר שטח לא יוני של 0.5% למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את הידרוג'ל עם שתי שטיפות חמש דקות בטמפרטורת החדר עם 250 microliters של PBS, בתוספת 300 גליצין מיליליטר לכל לשטוף, ואחריו טבילה של כל הידרוג'ל ב 250 microliters של חיץ חסימה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
סמן את התאים עם הנוגדנים העיקריים המתאימים מדוללים במאגר חסימה לילה בארבע מעלות צלזיוס, ואחריו שתי שטיפות ב 0.5% אמולסיה ריאגנט PBS של Dulbecco. לאחר הכביסה השנייה, סמן את התאים עם הנוגדן המשני הספציפי למין המתאים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור, לפני שטיפת התרבויות תלת-מיתיות פעמיים ב-0.5% אמולסיה של ריאגנט ו- PBS של Dulbecco, כפי שהוכח. כדי לדמיין את גרעיני התא, להוסיף DAPI, מדולל בריכוז של 1 עד 10000 PBS לדגימות לדגירה של שתי דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו שתי שטיפות ב 0.5% אמולסיה ריאגנט PBS של Dulbecco.
לאחר מכן השתמשו בצופים עדינים כדי להעביר כל דגימה לכלי צפייה מתאים. לאחר התביור, המיון והאנקפסולציה בהידרוגלים של קולגן, התאים יישארו מעוגלים בדרך כלל למשך 24 שעות, לפני שיתחילו לנדוד ויתווצרי לומן ראשוני. לאחר כשישה ימים של תרבות, מקלעת נימי פרימיטיבי יהיה גלוי הידרוג'ל כאשר צפו עם מיקרוסקופ שדה בהיר.
לאחר הדמיית הידרוג'לים קבועים, מוכתמים ועמוסי תאים במיקרוסקופ קונפוקלי, התמונות המעובדות מראש מומרות לשלד המאפשר ניתוח של האורך והקישוריות הכוללים של הרשת. זה הכרחי להוסיף אנטיביוטיקה לאחר FACS, כמו עיקור הפנים של מכשיר זה קשה, ולהסיר את האנטיביוטיקה 24 שעות לאחר אנקפסולציה התא. באמצעות טכניקה זו, הצלחנו לקבוע אילו מאפיינים פיזיקליים וכימיים מטריצה חוץ-תאית מחקה ביו-חומרים שולטים בפוטנציאל הווסקולוגני של שאבות אנדותל נגזרים שמקורם ב- iPSC.
