La creación de prototipos de redes genéticas sintéticas se mejora considerablemente mediante el uso de sistemas de expresión génica libres de células. Nuestro protocolo describe el proceso de fabricación para el reactor de flujo microfluídico multicapa y muestra que dicho dispositivo se puede utilizar para la expresión prolongada libre de células de GFP. Las expresiones de proteínas libres de células en combinación con reactores de flujo microfluídico proporcionan la plataforma de prototipado rápido para el diseño de dispositivos biológicos sintéticos.
Toda esta configuración es altamente versátil y se puede adaptar para la conducción de cualquier reacción bioquímica o química que requiera altos niveles de control. Garantizar la estabilidad de la solución de reacción libre de células es fundamental y difícil de lograr. Asegúrese de centrarse en proporcionar suficiente refrigeración y utilizar el tubo especificado en este protocolo.
La fabricación y preparación de la plataforma experimental requiere la conexión de numerosos componentes individuales, un proceso que puede ser difícil de seguir sin ayudas visuales. Para empezar, siga el protocolo de texto adjunto para fabricar el dispositivo microfluídico y configurar el control neumático y la regulación de la presión de flujo que se utilizará para controlar las válvulas críticas para este dispositivo. Para configurar el enfriamiento fuera de chip, comience enrollando una longitud de tubo de PTFE en la cara fría de un elemento Peltier y asegure la bobina con cinta adhesiva.
Asegúrese de que un extremo del tubo de PTFE esté conectado a los depósitos del sistema de control de presión de la capa de flujo y de que el otro extremo sobresalga no más de un centímetro de la superficie de Peltier. A continuación, inserte una longitud de cinco a 10 centímetros de tubo PEEK en el extremo saliente de la tubería de PTFE. Aplique una cantidad suficiente de compuesto térmico sobre la cara caliente del elemento Peltier y colóquelo en la placa fría del bloque de agua.
Asegúrese de que el tubo, el elemento Peltier y el bloque de refrigeración estén en contacto directo entre sí en todo momento. A continuación, conecte el elemento Peltier al controlador de temperatura mediante un conector de bus serie para que se pueda regular la tensión suministrada al Peltier. A continuación, coloque de forma segura un termistor en la superficie Peltier y conecte su salida al controlador de temperatura.
Después de encender el enfriador de agua, adapte la tensión suministrada al Peltier hasta que la temperatura sea estable a cuatro grados centígrados. Para cada canal de control del dispositivo microfluídico cortar una longitud de tubería estándar que es de un metro de largo. En un extremo, inserte el pasador de un talón Luer de 23 pulgadas, una media pulgada y, en el otro extremo, inserte un pasador de conexión de acero inoxidable.
Conecte el talón Luer a un conector de nylon con púas Luer de 3/32 pulgadas macho e inserte la púa del conector en una longitud de tubo de poliuretano. A continuación, inserte este tubo de poliuretano directamente en una de las válvulas solenoides. A continuación, conecte un talón Luer de media pulgada de calibre 23 a una jeringa e insértelo en una pieza de tubo estándar de tres a cuatro centímetros de largo.
Coloque el extremo abierto de este tubo en un depósito de agua ultra pura y llene la jeringa con agua ultra pura. Número cada canal de control del dispositivo microfluídico como se muestra aquí. Para los canales de cuatro a 29, busque el tubo correspondiente e inserte el pasador de metal en el extremo abierto del tubo unido a la jeringa.
A continuación, inyecte agua en el tubo del canal de control hasta que se haya llenado la mitad de la longitud. A continuación, desconecte el tubo de la jeringa e inserte el pasador del conector de acero inoxidable en el orificio correspondiente del dispositivo microfluídico. Repita este paso para todos los canales de control.
Ahora, utilice la interfaz de control para abrir todas las válvulas solenoides. Esto presurizará el fluido dentro del tubo del canal de control forzándolo en el dispositivo microfluídico y cerrando todas las válvulas basadas en membrana dentro del dispositivo. Para cada uno de los reactivos no refrigerados cortar una longitud de medidor de tubería estándar para conectar la salida del depósito a las entradas de dispositivo microfluídico.
Tome un extremo del tubo e insértelo en el depósito asegurándose de que el tubo llegue a la base del depósito. La salida del tubo del depósito debe apretarse para que se logre un sello hermético. A continuación, inserte un pasador de conexión inoxidable en el extremo abierto del tubo.
A continuación, coloque un talón Luer de media pulgada de calibre 23 al final de una jeringa de un mililitro. Añada una longitud corta de tubos estándar al talón Luer. Coloque el extremo del tubo en la solución de reactivo deseada y llene la jeringa con el reactivo.
A continuación, inserte el pasador del conector de acero inoxidable en el tubo de poliuretano conectado a la jeringa y llene el tubo con el reactivo. Cuando se utilizan pequeños volúmenes de reacción, el reactivo no entrará en el depósito y el tubo en sí actuará como el depósito. Cuando haya terminado, desconecte la jeringa e inserte el pasador del conector en uno de los orificios de entrada de la capa de flujo del dispositivo microfluídico.
A continuación, aplique presión a cada uno de los depósitos utilizando el software regulador de presión para forzar los reactivos en el dispositivo microfluídico. Asegúrese de que el enfriador de agua y los elementos Peltier se han encendido con la temperatura superficial del Peltier ajustada a cuatro grados Centígrados. Monte la configuración de refrigeración lo más cerca posible del dispositivo microfluídico para minimizar el volumen no refrigerado entre el Peltier y la entrada del dispositivo.
A continuación, conecte la jeringa de un mililitro a un talón Luer de media pulgada de calibre 23 con una longitud corta de tubo estándar unido al extremo. Dibuje el reactivo a enfriar para llenar la jeringa. A continuación, conecte el tubo PEEK a la jeringa a través del tubo de conexión y aplique una presión constante a la jeringa forzando el reactivo a través del tubo PEEK y en el tubo de PTFE.
Por último, desconecte el tubo PEEK de la jeringa e insértelo directamente en las entradas del canal de flujo del dispositivo microfluídico. Cuando se aplica presión, el reactivo refrigerado se forzará a entrar en el dispositivo microfluídico. Asegúrese de que el dispositivo microfluídico esté seguro en la etapa del microscopio con todos los tubos de control y capa de flujo conectados y cierre cualquier abertura en la incubadora.
A continuación, establezca la temperatura ambiente de la incubadora en 29 grados centígrados. A continuación, asegúrese de que el sistema de refrigeración se ha encendido y se establece en cuatro grados Celsius antes de iniciar el experimento. Compruebe que las presiones aplicadas al regulador de presión del canal de flujo se establecen en 800 milibar y, utilizando el software, ajuste la presión de salida de cada canal de flujo individual a entre 20 y 100 milibar.
Compruebe que las presiones aplicadas a las válvulas solenoides del canal de control son una barra para los canales uno a ocho y tres bar para los canales nueve a 29. A continuación, cierre la salida del dispositivo presurizando el canal 29 y despresurizar simultáneamente los canales de control del uno al tres y del 15 al 28. A continuación, despresuriza selectivamente los canales de control del multiplexor para permitir que un solo reactivo seleccionado fluya en el dispositivo.
Utilice el microscopio para controlar la extracción de aire y, posteriormente, asegurarse de que todos los reactivos fluyan correctamente sin introducir burbujas de aire. Utilizando el paquete de software proporcionado, configure los campos de datos relacionados con el proceso de calibración como se describe en el protocolo de texto adjunto. Posteriormente, determine el volumen de fluido desplazado de cada reactor durante un único paso de entrada mediante la ejecución del protocolo de calibración.
Siga los pasos presentados por el software de control para completar el análisis del experimento de calibración y determinar la relación de actualización de cada reactor de anillo en el dispositivo microfluídico. Por último, establezca los valores necesarios para el experimento deseado dentro de la interfaz de control virtual. Inicie el protocolo experimental pulsando el botón realizar experimento en la interfaz de control.
Durante un experimento de calibración, los reactores se llenan con un fluoróforo cuya intensidad se registra después de cada dilución. La disminución de la intensidad de fluorescencia por dilución revela el volumen del anillo del reactor desplazado para el número establecido de pasos de entrada. Este volumen se denomina relación de actualización.
La relación de actualización media y la desviación estándar se muestran para cada paso de dilución en rojo. Siete de los ocho reactores muestran un comportamiento muy similar, sin embargo, un reactor muestra fluctuaciones después del séptimo ciclo de dilución. Esto pone de relieve la necesidad de proporciones de actualización únicas para cada uno de los reactores.
La prolongada transcripción in vitro y la reacción de traducción mostrada aquí tenían el 30% del volumen del reactor desplazado cada 14,6 minutos. Dos reactores del dispositivo microfluídico donde se utilizan como espacios en blanco. Todos los demás reactores comprendían una solución de reacción de transcripción y traducción in vitro del 75% y el 25% de agua ultra pura o 2,5 plantillas de ADN lineal nanomolares que codifican para la expresión de la proteína deGFP.
En los cuatro reactores donde se añadió ADN, había una expresión clara de deGFP. Un reactor muestra una señal de fluorescencia inferior. Esto podría ser causado por la disparidad en el flujo que resulta en menos ADN que entra en el reactor o debido a variaciones en las dimensiones del reactor.
Después de 14 horas, se observa un aumento repentino en la señal de los reactores que contienen ADN. Esto es causado por una burbuja de aire que entra en la capa de flujo del dispositivo microfluídico. Tras la reanudación del flujo, el experimento vuelve a su intensidad de fluorescencia anterior.
Las soluciones de reacción sin células están sujetas a degradación con el tiempo a menos que estén lo suficientemente enfriadas, haga que el proceso de enfriamiento descrito en este protocolo de importancia crítica. Debido a la versatilidad de la plataforma, una variedad de reacciones bioquímicas y químicas se pueden llevar a cabo de una manera precisa y controlada. La aplicación de reactores de flujo microfluídico ha acelerado los sucesivos ciclos de prueba de construcción de diseño para la creación de prototipos de doble circuito genético.
