La prototipazione delle reti geniche sintetiche è notevolmente migliorata dall'uso di sistemi di espressione genica liberi dalle cellule. Il nostro protocollo descrive il processo di fabbricazione per il reattore a flusso microfluidico multistrato e mostra che tale dispositivo può essere utilizzato per l'espressione prolungata senza cellule della GFP. Le espressioni proteiche senza cellule in combinazione con i reattori a flusso microfluidico forniscono la piattaforma di prototipazione rapida per la progettazione di dispositivi biologici sintetici.
L'intera configurazione è altamente versatile e può essere adattata per la conduzione di qualsiasi reazione biochimica o chimica che richieda alti livelli di controllo. Garantire la stabilità della soluzione di reazione priva di cellule è fondamentale e difficile da raggiungere. Assicurati di concentrarti sul fornire un raffreddamento sufficiente e utilizzare i tubi specificati in questo protocollo.
La fabbricazione e la preparazione della piattaforma sperimentale richiede il collegamento di numerosi singoli componenti, un processo che può essere difficile da seguire senza ausili visivi. Per iniziare, seguire nel protocollo di testo di accompagnamento per fabbricare il dispositivo microfluidico e impostare il controllo pneumatico e la regolazione della pressione di flusso che verrà utilizzato per controllare le valvole critiche per questo dispositivo. Per impostare il raffreddamento off-chip, iniziare avvolgendo una lunghezza di tubi PTFE sulla faccia fredda di un elemento Peltier e fissare la bobina con del nastro adesivo.
Assicurarsi che un'estremità del tubo PTFE sia collegata ai serbatoi del sistema di controllo della pressione dello strato di flusso e che l'altra estremità sporge non più di un centimetro dalla superficie Peltier. Inserire quindi una lunghezza da cinque a 10 centimetri di tubi PEEK nell'estremità sporgente del tubo PTFE. Applicare una quantità sufficiente di composto termico sulla faccia calda dell'elemento Peltier e posizionarlo sulla piastra fredda del blocco d'acqua.
Assicurarsi che il tubo, l'elemento Peltier e il blocco di raffreddamento siano sempre a diretto contatto tra loro. Collegare quindi l'elemento Peltier al regolatore di temperatura utilizzando un connettore bus seriale in modo che la tensione fornita al Peltier possa essere regolata. Quindi, posizionare in modo sicuro un termistore sulla superficie Peltier e collegarne l'uscita al regolatore di temperatura.
Dopo aver accendeto il refrigeratore d'acqua, adattare la tensione fornita al Peltier fino a quando la temperatura è stabile a quattro gradi Celsius. Per ogni canale di controllo del dispositivo microfluidico tagliare una lunghezza di tubi standard lunga un metro. Ad un'estremità, inserire il perno di uno stub Luer da 23 gauge, un mezzo pollice e all'altra estremità inserire un perno di collegamento in acciaio inossidabile.
Collegare lo stub Luer a un connettore maschio in nylon spinato Luer da 3/32 pollici e inserire la spina del connettore in una lunghezza di tubi in poliuretano. Quindi inserire questo tubo in poliuretano direttamente in una delle valvole solenoidi. Quindi attacca uno stub Luer da 23 pollici calibro a una siringa e inserisci questo in un pezzo di tubi standard lungo da tre a quattro centimetri.
Posizionare l'estremità aperta di questo tubo in un serbatoio di acqua ultra pura e riempire la siringa con acqua ultra pura. Numerare ogni canale di controllo del dispositivo microfluidico come mostrato qui. Per i canali da quattro a 29, trovare i tubi corrispondenti e inserire il perno metallico nell'estremità aperta del tubo attaccato alla siringa.
Quindi iniettare acqua nel tubo del canale di controllo fino a quando metà della lunghezza è stata riempita. Quindi, scollegare il tubo dalla siringa e inserire il perno del connettore in acciaio inossidabile nel foro corrispondente del dispositivo microfluidico. Ripetere questo passaggio per tutti i canali di controllo.
Ora, usa l'interfaccia di controllo per aprire tutte le valvole solenoidi. Ciò premerà il fluido all'interno del tubo del canale di controllo forzarlo nel dispositivo microfluidico e chiudere tutte le valvole a membrana all'interno del dispositivo. Per ciascuno dei reagenti non raffreddati tagliare una lunghezza di metro di tubi standard per collegare l'uscita del serbatoio alle entrate del dispositivo microfluidico.
Prendere un'estremità del tubo e inserirlo nel serbatoio assicurando che il tubo raggiunga la base del serbatoio. L'uscita del tubo del serbatoio deve essere stretta in modo da ottenere una tenuta ermetica. Quindi, inserire un perno di connessione inossidabile nell'estremità aperta del tubo.
Quindi, attaccare uno stub Luer da 23 pollici all'estremità di una siringa da millelitro. Aggiungere una breve lunghezza di tubi standard allo stub Luer. Posizionare l'estremità del tubo nella soluzione reagente desiderata e riempire la siringa con il reagente.
Quindi inserire il perno del connettore in acciaio inossidabile nel tubo in poliuretano collegato alla siringa e riempire il tubo con il reagente. Quando si utilizzano piccoli volumi di reazione, il reagente non entrerà nel serbatoio e il tubo stesso fungerà da serbatoio. Al termine, scollegare la siringa e inserire il perno del connettore in uno dei fori di ingresso dello strato di flusso del dispositivo microfluidico.
Quindi applicare pressione a ciascuno dei serbatoi utilizzando il software di regolatore di pressione per forzare i reagenti nel dispositivo microfluidico. Assicurarsi che il refrigeratore d'acqua e gli elementi Peltier siano stati accesi con la temperatura superficiale del Peltier impostata a quattro gradi Celsius. Montare la configurazione di raffreddamento il più vicino possibile al dispositivo microfluidico per ridurre al minimo il volume non raffreddato tra peltier e l'ingresso del dispositivo.
Quindi collegare quella della siringa da un millilitro a uno stub Luer da 23 pollici calibro con una breve lunghezza di tubi standard attaccati all'estremità. Disegnare nel reagente da raffreddare per riempire la siringa. Collegare quindi il tubo PEEK alla siringa tramite il tubo connettivo e applicare una pressione costante sulla siringa forzando il reagente attraverso i tubi PEEK e nei tubi PTFE.
Infine scollegare il tubo PEEK dalla siringa e inserirlo direttamente nelle entrate del canale di flusso del dispositivo microfluidico. Quando viene applicata la pressione, il reagente raffreddato verrà forzato nel dispositivo microfluidico. Assicurarsi che il dispositivo microfluidico sia sicuro sullo stadio del microscopio con tutti i tubi di controllo e strato di flusso collegati e chiudere eventuali aperture sull'incubatore.
Impostare quindi la temperatura ambiente dell'incubatore su 29 gradi Celsius. Assicurarsi quindi che il sistema di raffreddamento sia stato acceso e sia impostato su quattro gradi Celsius prima di avviare l'esperimento. Verificare che le pressioni applicate al regolatore di pressione del canale di flusso sia impostato su 800 millibar e utilizzando il software, impostare la pressione di uscita di ogni singolo canale di flusso su un tra 20 e 100 millibar.
Verificare che le pressioni applicate alle valvole solenoidi del canale di controllo sia di una barra per i canali da una a otto e tre barre per i canali da nove a 29. Quindi, chiudere l'uscita del dispositivo pressurizzando il canale 29 e depressurizzare contemporaneamente i canali di controllo da uno a tre e da 15 a 28. Quindi depressurizzare selettivamente i canali di controllo del multiplexer per consentire a un singolo reagente selezionato di fluire nel dispositivo.
Utilizzare il microscopio per monitorare la rimozione dell'aria e successivamente assicurarsi che tutti i reagenti fluiranno correttamente senza introdurre bolle d'aria. Utilizzando il pacchetto software fornito, impostare i campi dati relativi al processo di calibrazione come descritto nel protocollo di testo allegato. Successivamente determinare il volume del fluido spostato da ciascun reattore durante una singola fase di afflusso eseguendo il protocollo di taratura.
Seguire i passaggi presentati dal software di controllo per completare l'analisi dell'esperimento di taratura e determinare il rapporto di aggiornamento di ciascun reattore ad anello nel dispositivo microfluidico. Infine, impostare i valori necessari per l'esperimento desiderato all'interno dell'interfaccia di controllo virtuale. Avviare il protocollo sperimentale premendo il pulsante Esegui esperimento nell'interfaccia di controllo.
Durante un esperimento di taratura i reattori sono riempiti con un fluoroforo la cui intensità viene registrata dopo ogni diluizione. La diminuzione dell'intensità di fluorescenza per diluizione rivela il volume dell'anello del reattore spostato per il numero prestabilito di fasi di afflusso. Questo volume è definito rapporto di aggiornamento.
Il rapporto di aggiornamento medio e la deviazione standard vengono visualizzati per ogni passaggio di diluizione in rosso. Sette degli otto reattori mostrano un comportamento molto simile, tuttavia un reattore mostra fluttuazioni dopo il settimo ciclo di diluizione. Ciò evidenzia la necessità di rapporti di aggiornamento unici per ciascuno dei reattori.
La prolungata reazione di trascrizione e traduzione in vitro qui mostrata ha fatto spostare il 30% del volume del reattore ogni 14,6 minuti. Due reattori del dispositivo microfluidico se utilizzati come spazi vuoti. Tutti gli altri reattori comprendevano il 75% di soluzione di reazione di trascrizione e traslazione in vitro e il 25% di acqua ultra pura o modelli di DNA lineare nanomolare 2,5 che codificano per l'espressione della proteina deGFP.
In tutti e quattro i reattori in cui è stato aggiunto il DNA, c'era una chiara espressione del deGFP. Un reattore mostra un segnale di fluorescenza inferiore. Ciò potrebbe essere causato da disparità di flusso che si traduce in una minore entrata del DNA nel reattore o a causa delle variazioni nelle dimensioni del reattore.
Dopo 14 ore, si vede un improvviso aumento del segnale dei reattori contenenti DNA. Ciò è causato da una bolla d'aria che entra nello strato di flusso del dispositivo microfluidico. Alla ripresa del flusso, l'esperimento ritorna alla sua precedente intensità di fluorescenza.
Le soluzioni di reazione senza cellule sono soggette a degradazione nel tempo a meno che non siano sufficientemente raffreddate, rendono il processo di raffreddamento descritto in questo protocollo di importanza critica. Grazie alla versatilità della piattaforma, una varietà di reazioni biochimiche e chimiche possono essere condotte in modo preciso e controllato. L'applicazione di reattori a flusso microfluidico ha accelerato i successivi cicli di test di costruzione della progettazione per la prototipazione di doppi circuiti genetici.
