Прототипирование синтетических генных сетей значительно улучшается за счет использования систем экспрессии генов, свободных от клеток. Наш протокол описывает процесс изготовления многослойного реактора микрофлюидного потока и показывает, что такое устройство может быть использовано для длительного безклеточного выражения GFP. Безклеточные белковые выражения в сочетании с реакторами микрофлюидного потока обеспечивают быструю платформу прототипирования для проектирования синтетических биологических устройств.
Вся эта установка является весьма универсальным и может быть адаптирована для проведения любых биохимических или химических реакций, требующих высокого уровня контроля. Обеспечение стабильности решения для реакции без клеток имеет решающее значение и трудно достичь. Не забудьте сосредоточиться на обеспечении достаточного охлаждения и использовать трубки, указанные в этом протоколе.
Изготовление и подготовка экспериментальной платформы требует соединения многочисленных отдельных компонентов, процесс, который может быть трудно следовать без визуальных средств. Для начала следуйте сопроводительному текстовому протоколу, чтобы изготовить микрофлюидное устройство и настроить пневматическое регулирование управления и давления потока, которое будет использоваться для управления клапанами, критически важными для этого устройства. Чтобы настроить вне чип охлаждения, начните с катушки длины PTFE трубки на холодную сторону элемента Peltier и обеспечить катушки с лентой.
Убедитесь, что один конец трубки PTFE подключен к резервуарам системы управления давлением слоя потока, а другой конец выступает не более чем на один сантиметр от поверхности Пелтиера. Затем вставьте длину от 5 до 10 сантиметров труб PEEK в выступающий конец трубки PTFE. Нанесите достаточное количество теплового соединения на горячее лицо элемента Пелтиера и поместите его на холодную плиту водяного блока.
Убедитесь, что трубки, элемент Peltier и охлаждающий блок находятся в непосредственном контакте друг с другом в любой момент. Затем подключите элемент Peltier к регулятору температуры с помощью разъема серийного автобуса, чтобы напряжение, поставляемое в Peltier, можно было регулировать. Затем надежно поместите термистор на поверхность Пелтиера и соедините его выход с температурный контроллер.
Включив охладитель воды, адаптируем напряжение, поставляемое в Пелтиер, до тех пор, пока температура не будет стабильной на уровне четырех градусов по Цельсию. Для каждого канала управления микрофлюидного устройства вырезать длину стандартных труб, что составляет один метр в длину. С одной стороны, вставьте штифт 23 калибра, один почерпяйма Luer заглушки и на другом конце вставить нержавеющей стали соединительный штифт.
Подключите заглушку Luer к мужскому разъему Luer 3/32 дюйма из колючего нейлона и вставьте колючку разъема в длину полиуретановых труб. Затем вставьте эту полиуретановую трубку прямо в один из соленоидных клапанов. Затем прикрепите 23-дюймовый полудюймовый заглушку Luer к шприцу и вставьте это в трех-четырехметровый кусок стандартной трубки.
Поместите открытый конец этой трубки в резервуар ультра чистой воды и заполнить шприц с ультра чистой водой. Номер каждого канала управления микрофлюидного устройства, как показано здесь. Для каналов от четырех до 29, найти соответствующие трубки и вставить металлический штифт в открытый конец трубки прилагается к шприцу.
Затем ввините воду в трубы канала управления до тех пор, пока половина длины не будет заполнена. Затем отсоедините трубку от шприца и вставьте булавку разъема из нержавеющей стали в соответствующее отверстие микрофлюидного устройства. Повторите этот шаг для всех каналов управления.
Теперь используйте интерфейс управления, чтобы открыть все соленоидные клапаны. Это будет оказывать давление на жидкость в пределах канала управления трубки заставляя его в микрофлюидное устройство и закрытие всех мембранных клапанов в устройстве. Для каждого из неохлажденых реагентов вырезать метр длиной стандартных труб для подключения розетки резервуара для микрофлюидных входов устройства.
Возьмите один конец трубки и вставьте это в резервуар, гарантируя, что трубка достигает основания резервуара. Выход труб резервуара должен быть затянут так, чтобы герметичное уплотнение было достигнуто. Затем вставьте булавку нержавеющего соединения в открытый конец трубки.
Затем прикрепите 23-дюймовый заглушку Luer к концу одного миллилитрового шприца. Добавьте короткую длину стандартных труб в заглушку Luer. Поместите конец трубки в желаемый раствор реагента и заполните шприц реагентом.
Затем вставьте булавку разъема из нержавеющей стали в полиуретановые трубки, подключенные к шприцу, и заполните трубку реагентом. При использовании небольших объемов реакции реагент не войдет в резервуар, а сам тюбинг будет выступать в качестве резервуара. После завершения, отсоедините шприц и вставьте штифт разъема в одно из отверстий в входе слоя потока микрофлюидного устройства.
Затем нанесите давление на каждый из резервуаров с помощью программного обеспечения регулятора давления, чтобы заставить реагенты в микрофлюидное устройство. Убедитесь, что охладитель воды и элементы Peltier были включены с температурой поверхности Peltier установлен на четыре градуса по Цельсию. Установка охлаждения как можно ближе к микрофлюидным устройствам, чтобы свести к минимуму неохлажденый объем между Peltier и входом устройства.
Затем подключите один миллилитровый шприц к 23 калибра половины дюйма Luer заглушки с короткой длиной стандартных труб прилагается к концу. Нарисуйте в, чтобы быть охлажденным реагентом, чтобы заполнить шприц. Затем подключите трубки PEEK к шприцу через соединительной трубки и применяем постоянное давление на шприц, заставляя реагент через трубки PEEK и в трубки PTFE.
Окончательно отключите трубку PEEK от шприца и вставьте его сразу в входы канала потока микрофлюидного прибора. При давлении охлажденный реагент будет зануден в микрофлюидное устройство. Убедитесь, что микрофлюидное устройство является безопасным на стадии микроскопа со всеми контроля и потока слоя трубки прилагается и закрыть любые отверстия на инкубаторе.
Далее установите температуру окружающей среды инкубатора до 29 градусов по Цельсию. Затем убедитесь, что система охлаждения была включена и установлена на четыре градуса по Цельсию до начала эксперимента. Убедитесь, что давление, оказываемое на регулятор давления канала потока, установлено на уровне 800 миллибар и с помощью программного обеспечения установите выходное давление каждого отдельного канала потока до 20-100 миллибар.
Убедитесь, что давление, применяемое к соленоидным клапанам канала управления, составляет один бар для каналов от одного до восьми и три бара для каналов с девяти по 29. Затем закройте розетку устройства, давя на канал 29 и одновременно разгерметизируйте каналы управления от 1 до 3 и с 15 по 28. Затем выборочно разгерметизируйте каналы управления мультиплексера, чтобы один выбранный реагент попал в устройство.
Используйте микроскоп для мониторинга удаления воздуха и впоследствии убедитесь, что все реагенты текут правильно, не вводя пузырьки воздуха. Используя предоставленный пакет программного обеспечения, найте поля данных, связанные с процессом калибровки, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Впоследствии определите объем жидкости, перемещенной из каждого реактора в течение одного шага притока, выполняя протокол калибровки.
Следуйте вместе с шагами, представленными программным обеспечением управления, чтобы завершить анализ эксперимента по калибровке и определить коэффициент обновления каждого кольцевого реактора в микрофлюидном устройстве. Наконец, установите необходимые значения для желаемого эксперимента в виртуальном интерфейсе управления. Инициировать экспериментальный протокол, нажав кнопку выполнения эксперимента в интерфейсе управления.
Во время калибровочного эксперимента реакторы заполняются флюорофором, интенсивность которого регистрируется после каждого разбавления. Снижение интенсивности флуоресценции на разбавление показывает объем реакторного кольца, смещенного для установленного количества ступеней притока. Этот объем называют коэффициентом обновления.
Среднее соотношение обновления и стандартное отклонение отображаются для каждого шага разбавления красным цветом. Семь из восьми реакторов показывают очень похожее поведение, однако один реактор показывает колебания после седьмого цикла разбавления. Это подчеркивает необходимость уникальных коэффициентов обновления для каждого из реакторов.
Длительная стенограмма in vitro и реакция перевода, показанные здесь, имели 30% объема реактора, перемещенного каждые 14,6 минут. Два реактора микрофлюидного устройства, где используется в качестве заготовки. Все остальные реакторы состояли из 75% транскриптии in vitro и решения реакции перевода и 25% либо ультра чистой воды, либо 2,5 наномолярных линейных шаблонов ДНК, кодирующих для выражения белка deGFP.
Во всех четырех реакторах, где была добавлена ДНК, было четкое выражение deGFP. Один реактор отображает более низкий сигнал флуоресценции. Это может быть вызвано несоответствием потока, приводящего к меньшему вводу ДНК в реактор, или изменениями размеров реактора.
Через 14 часов в сигнале реакторов, содержащих ДНК, наблюдается внезапное увеличение. Это вызвано пузырьком воздуха, входящим в слой потока микрофлюидного устройства. После возобновления потока эксперимент возвращается к прежней интенсивности флуоресценции.
Решения для реакции без клеток со временем подвергаются деградации, если они не достаточно охлаждаются, что делает процесс охлаждения, описанный в этом протоколе, критически важным. Благодаря универсальности платформы, различные биохимические и химические реакции могут быть проведены в точной и контролируемой манере. Применение реакторов микрофлюидного потока ускорило последовательные циклы испытаний конструкции сборки для прототипирования двойных генетических схем.
