A prototipagem de redes genéticas sintéticas é muito melhorada pelo uso de sistemas de expressão genética livre de células. Nosso protocolo descreve o processo de fabricação do reator de fluxo microfluido multicamadas e mostra que tal dispositivo pode ser usado para uma expressão prolongada livre de células de GFP. Expressões proteicas livres de células em combinação com reatores de fluxo microfluido fornecem a plataforma de prototipagem rápida para o design de dispositivos biológicos sintéticos.
Toda esta configuração é altamente versátil e pode ser adaptada para a condução de quaisquer reações bioquímicas ou químicas que exijam altos níveis de controle. Garantir a estabilidade da solução de reação sem células é fundamental e difícil de alcançar. Certifique-se de se concentrar em fornecer resfriamento suficiente e utilizar o tubo especificado neste protocolo.
Fabricar e preparar a plataforma experimental requer a conexão de inúmeros componentes individuais, um processo que pode ser difícil de seguir sem auxílios visuais. Para começar, acompanhe o protocolo de texto que acompanha a fabricação do dispositivo microfluido e a configuração do controle pneumático e da regulação da pressão de fluxo que será usado para controlar as válvulas críticas a este dispositivo. Para configurar o resfriamento off-chip, comece enrolando um comprimento de entubação PTFE na face fria de um elemento Peltier e fixar a bobina com fita.
Certifique-se de que uma extremidade da tubulação PTFE esteja conectada aos reservatórios do sistema de controle de pressão da camada de fluxo e que a outra extremidade não se projete mais de um centímetro da superfície peltier. Em seguida, insira um comprimento de cinco a 10 centímetros de tubo PEEK na extremidade saliente da tubulação PTFE. Aplique uma quantidade suficiente de composto térmico na face quente do elemento Peltier e coloque-o sobre a placa fria do bloco de água.
Certifique-se de que o tubo, o elemento Peltier e o bloco de resfriamento estejam em contato direto um com o outro o tempo todo. Em seguida, conecte o elemento Peltier ao controlador de temperatura usando um conector de barramento serial para que a tensão fornecida ao Peltier possa ser regulada. Em seguida, coloque com segurança um ormistor na superfície peltier e conecte sua saída ao controlador de temperatura.
Depois de ligar o bebedouro, adapte a tensão fornecida ao Peltier até que a temperatura esteja estável a quatro graus Celsius. Para cada canal de controle do dispositivo microfluido corte um comprimento de tubulação padrão que tem um metro de comprimento. Em uma extremidade, insira o pino de um medidor de 23, um stub Luer de meia polegada e na outra extremidade insira um pino de conexão de aço inoxidável.
Conecte o stub Luer a um conector de nylon farpado luer de 3/32 polegadas e insira a barb do conector em um comprimento de tubo de poliuretano. Em seguida, insira este tubo de poliuretano diretamente em uma das válvulas solenoides. Em seguida, conecte um trecho Luer de meia polegada de calibre 23 a uma seringa e insira-o em uma peça de tubo padrão de três a quatro centímetros de comprimento.
Coloque a extremidade aberta deste tubo em um reservatório de água ultra pura e encha a seringa com água ultra pura. Número cada canal de controle do dispositivo microfluido como mostrado aqui. Para os canais quatro a 29, encontre a tubulação correspondente e insira o pino de metal na extremidade aberta da tubulação presa à seringa.
Em seguida, injete água na tubulação do canal de controle até que metade do comprimento tenha sido preenchido. Em seguida, desconecte a tubulação da seringa e insira o pino do conector de aço inoxidável no orifício correspondente do dispositivo microfluido. Repita este passo para todos os canais de controle.
Agora, use a interface de controle para abrir todas as válvulas solenoides. Isso pressurizará o fluido dentro da tubulação do canal de controle forçando-o para dentro do dispositivo microfluido e fechando todas as válvulas baseadas em membrana dentro do dispositivo. Para cada um dos reagentes não cozidos corte um comprimento de metro de tubulação padrão para conectar a saída do reservatório às entradas do dispositivo microfluido.
Pegue uma extremidade da tubulação e insira isso no reservatório garantindo que o tubo atinja a base do reservatório. A saída de tubulação do reservatório deve ser apertada para que uma vedação hermética seja alcançada. Em seguida, insira um pino de conexão inoxidável na extremidade aberta da tubulação.
Em seguida, conecte um stub Luer de meia polegada de calibre 23 até a extremidade de uma seringa de um mililitro. Adicione um curto comprimento de tubulação padrão ao stub Luer. Coloque a extremidade da tubulação na solução de reagente desejada e encha a seringa com o reagente.
Em seguida, insira o pino do conector de aço inoxidável na tubulação de poliuretano conectada à seringa e encha o tubo com o reagente. Ao utilizar pequenos volumes de reação, o reagente não entrará no reservatório e o tubo em si funcionará como o reservatório. Quando terminar, desconecte a seringa e insira o pino do conector em um dos orifícios de entrada da camada de fluxo do dispositivo microfluido.
Em seguida, aplique pressão em cada um dos reservatórios usando o software regulador de pressão para forçar os reagentes para o dispositivo microfluido. Certifique-se de que o refrigerador de água e os elementos Peltier tenham sido ligados com a temperatura da superfície do Peltier fixada em quatro graus Celsius. Monte a configuração de resfriamento o mais próximo possível do dispositivo microfluido para minimizar o volume não legal entre o Peltier e a entrada do dispositivo.
Em seguida, conecte a uma seringa mililitro a um stub Luer de meia polegada de calibre 23 com um comprimento curto de tubulação padrão presa à extremidade. Desenhe o reagente para ser resfriado para encher a seringa. Em seguida, conecte a tubulação PEEK à seringa através da tubulação conjuntiva e aplique pressão constante na seringa forçando o reagente através da tubulação PEEK e na tubulação PTFE.
Por fim, desconecte a tubulação PEEK da seringa e insira-a diretamente nas entradas do canal de fluxo do dispositivo microfluido. Quando a pressão é aplicada, o reagente resfriado será forçado a entrar no dispositivo microfluido. Certifique-se de que o dispositivo microfluido esteja seguro no estágio do microscópio com toda a tubulação de camada de controle e fluxo anexada e feche quaisquer aberturas na incubadora.
Em seguida, coloque a temperatura ambiente da incubadora para 29 graus Celsius. Em seguida, assegure-se de que o sistema de resfriamento foi ligado e está definido para quatro graus Celsius antes de iniciar o experimento. Verifique se as pressões aplicadas ao regulador de pressão do canal de fluxo estão definidas para 800 milibares e usando o software, defina a pressão de saída de cada canal de fluxo individual entre 20 e 100 milibares.
Verifique se as pressões aplicadas nas válvulas solenoides do canal de controle é uma barra para os canais de um a oito e três barras para os canais nove a 29. Em seguida, feche a tomada do dispositivo pressurizando o canal 29 e simultaneamente despressurize os canais de controle de um a três e de 15 a 28. Em seguida, despressurize seletivamente os canais de controle do multiplexer para permitir que um único reagente selecionado flua para dentro do dispositivo.
Use o microscópio para monitorar a remoção do ar e, posteriormente, garantir que todos os reagentes fluam corretamente sem introduzir bolhas de ar. Usando o pacote de software fornecido, configure os campos de dados relacionados ao processo de calibração conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Determine posteriormente o volume de fluido deslocado de cada reator durante uma única etapa de entrada executando o protocolo de calibração.
Acompanhe as etapas apresentadas pelo software de controle para concluir a análise do experimento de calibração e determinar a razão de atualização de cada reator de anel no dispositivo microfluido. Por fim, defina os valores necessários para o experimento desejado dentro da interface de controle virtual. Inicie o protocolo experimental pressionando o botão de teste de execução na interface de controle.
Durante um experimento de calibração, os reatores são preenchidos com um fluoróforo cuja intensidade é registrada após cada diluição. A diminuição da intensidade de fluorescência por diluição revela o volume do anel do reator deslocado para o número definido de etapas de entrada. Este volume é chamado de razão de atualização.
A relação média de atualização e o desvio padrão são mostrados para cada passo de diluição em vermelho. Sete dos oito reatores mostram comportamento muito semelhante, no entanto um reator mostra flutuações após o sétimo ciclo de diluição. Isso destaca a necessidade de relações de atualização únicas para cada um dos reatores.
A transcrição in vitro prolongada e a reação de tradução mostrada aqui tiveram 30% do volume do reator deslocado a cada 14,6 minutos. Dois reatores do dispositivo microfluido onde usado como espaços em branco. Todos os outros reatores consistiram em 75% de transcrição in vitro e solução de reação de tradução e 25% de água ultra pura ou 2,5 modelos de DNA linear nanomolar codificando para a expressão da proteína degfp.
Em todos os quatro reatores onde o DNA foi adicionado, havia uma clara expressão de DEGFP. Um reator exibe um sinal de fluorescência inferior. Isso pode ser causado pela disparidade no fluxo, resultando em menos DNA entrando no reator ou devido a variações nas dimensões do reator.
Após 14 horas, um aumento repentino é visto no sinal dos reatores contendo DNA. Isso é causado por uma bolha de ar que entra na camada de fluxo do dispositivo microfluido. Após a retomada do fluxo, o experimento retorna à intensidade anterior da fluorescência.
As soluções de reação sem células estão sujeitas à degradação ao longo do tempo, a menos que sejam suficientemente resfriadas, faça com que o processo de resfriamento descrito neste protocolo de importância crítica. Devido à versatilidade da plataforma, uma variedade de reações bioquímicas e químicas pode ser conduzida de forma precisa e controlada. A aplicação de reatores de fluxo microfluido acelerou ciclos sucessivos de projeto de construção de ciclos de teste para prototipagem de circuitos genéticos duplos.
