Sentetik gen ağlarının prototiplemesi, hücre içermeyen gen ekspresyon sistemlerinin kullanımı ile büyük ölçüde geliştirilir. Protokolümüz çok katmanlı mikroakışkan akış reaktörü için üretim sürecini açıklar ve böyle bir cihazın GFP'nin uzun süreli hücresiz ifade için kullanılabileceğini göstermektedir. Mikroakışkan akış reaktörleri ile birlikte hücre içermeyen protein ifadeleri sentetik biyolojik cihazların tasarımı için hızlı prototipleme platformu sağlar.
Bu tüm kurulum son derece çok yönlüdür ve yüksek düzeyde kontrol gerektiren herhangi bir biyokimyasal veya kimyasal reaksiyonun iletimi için uyarlanabilir. Hücresiz reaksiyon çözeltisinin stabilitesini sağlamak çok önemlidir ve elde edilmesi zordur. Yeterli soğutma sağlamaya odaklanmayı ve bu protokolde belirtilen boruları kullanmayı unutmayın.
Deneysel platformun üretilmesi ve hazırlanması, görsel yardımlar olmadan takip edilmesi zor bir süreç olan çok sayıda tek tek bileşenin bağlantısını gerektirir. Başlamak için, mikroakışkan cihazı imal etmek ve bu cihaz için kritik valfleri kontrol etmek için kullanılacak pnömatik kontrol ve akış basıncı regülasyonkurmak için eşlik eden metin protokolü izleyin. Off-chip soğutma kurmak için, bir Peltier elemanın soğuk yüzüne PTFE boru bir uzunluk bobin ile başlamak ve bant ile bobin güvenli.
PTFE borunun bir ucunun akış katmanı basınç kontrol sisteminin rezervuarlarına bağlı olduğundan ve diğer ucunun Peltier yüzeyinden en fazla bir santimetre çıkıntı yaptığından emin olun. Bir sonraki ekleme PTFE boru çıkıntılı sonuna PEEK boru beş ila 10 santimetre uzunluğunda. Peltier elementinin sıcak yüzüne yeterli miktarda termal bileşik uygulayın ve su bloğunun soğuk plakasına yerleştirin.
Boru, Peltier elemanı ve soğutma bloğunun her zaman birbiriyle doğrudan temas halinde olduğundan emin olun. Daha sonra Peltier elemanını bir seri veri günü konektörü kullanarak sıcaklık kontrol cihazına bağlayın, böylece Peltier'e verilen voltaj düzenlenebilir. Ardından, Peltier yüzeyine güvenli bir şekilde bir termistör yerleştirin ve çıkışını sıcaklık kontrol örüne bağlayın.
Su soğutucuyu açtıktan sonra, peltier'e verilen gerilimi sıcaklık dört santigrat derecede sabit olana kadar uyarlayın. Mikroakışkan cihazın her kontrol kanalı için bir metre uzunluğunda standart boru uzunluğu kesti. Bir ucunda, bir 23 göstergesi, yarım inç Luer saplama pin ve diğer ucunda paslanmaz çelik bağlantı pimi takın takın.
Luer sapı bir erkek Luer 3/32 inç dikenli naylon konektör bağlayın ve poliüretan boru uzunluğu içine konektör ünbarb takın. Daha sonra bu poliüretan boruyu doğrudan solenoid kapakçıklardan birine takın. Sonraki bir şırınga için 23 gauge yarım inç Luer saplama ekleyin ve standart boru üç ila dört santimetre uzunluğunda parça içine bu takın.
Bu borunun açık ucunu ultra saf su deposuna yerleştirin ve şırıngayı ultra saf suyla doldurun. Burada gösterildiği gibi mikroakışkan cihazın her kontrol kanalını numaralandırma. 4'ten 29'a kadar olan kanallar için, ilgili tüpü bulun ve metal pimi şırıngaya bağlı borunun açık ucuna takın.
Daha sonra kontrol kanalı borusu içine yarım uzunluğu dolduruldu kadar su enjekte. Ardından, şırıngadan boruyu kesin ve paslanmaz çelik konektör pimini mikroakışkan cihazın ilgili deliğine takın. Tüm denetim kanalları için bu adımı yineleyin.
Şimdi, tüm solenoid vanaları açmak için kontrol arabirimini kullanın. Bu, kontrol kanalı tüpündeki sıvıyı mikroakışkan cihaza zorlayarak ve cihaz içindeki tüm membran tabanlı vanaları kapatarak basınçlendirecektir. Soğutulmamış reaktiflerin her biri için mikroakışkan cihaz girişlerine rezervuar çıkışı bağlamak için standart boru bir metre uzunluğunda kesti.
Tüpün bir ucunu alın ve bunu rezervuarın tabanına ulaşmasını sağlayarak rezervuara takın. Rezervuar boru çıkışı, hava geçirmez bir sızdırmazlık elde edilebilmek için sıkılmalıdır. Ardından, borunun açık ucuna paslanmaz bir bağlantı pimi takın.
Daha sonra, bir mililitreşile şırınga sonuna 23 gauge yarım inç Luer saplama takın. Luer sapı için standart boru kısa bir uzunluk ekleyin. Borunun ucunu istenilen reaktif çözeltisine yerleştirin ve şırıngayı reaktifle doldurun.
Daha sonra paslanmaz çelik konektör pimini şırıngaya bağlı poliüretan boruya takın ve boruyu reaktifle doldurun. Küçük reaksiyon hacimleri kullanırken, reaktif rezervuara girmez ve borunun kendisi rezervuar görevi göremez. Bittiğinde, şırıngayı kesin ve konektör pimini mikroakışkan cihazın akış katmanı giriş deliklerinden birine takın.
Daha sonra reaktifleri mikroakışkan cihaza zorlamak için basınç düzenleyici yazılımı kullanarak rezervuarların her birine basınç uygulayın. Peltier setinin yüzey sıcaklığı dört dereceye kadar açık olduğundan emin olun. Peltier ve cihaz girişi arasındaki soğutulmamış hacmi en aza indirmek için soğutma kurulumuna mümkün olduğunca mikroakışkan cihaza yakın monte edin.
Sonra bir mililitreşşır 23 gauge yarım inç Luer saplama için standart boru kısa bir uzunlukta sonuna bağlı bağlayın. Şırıngayı doldurmak için soğutulmuş reaktifi çekin. Daha sonra PEEK boruyu bağ borusu aracılığıyla şırıngaya bağlayın ve reaktifi PEEK tüpünden PTFE tüpüne zorlayarak şırıngaya sabit basınç uygulayın.
Son olarak PEEK tüpünün şırıngadan bağlantısını kesin ve doğrudan mikroakışkan cihazın akış kanalı girişlerine takın. Basınç uygulandığında, soğutulmuş reaktif mikroakışkan cihaza zorlanır. Mikroakışkan cihazın mikroskop aşamasında tüm kontrol ve akış tabakası boruları takılı olduğundan emin olun ve kuvözdeki tüm açıklıkları kapatın.
Bir sonraki kuvözdeki ortam sıcaklığını 29 dereceye ayarlayın. Daha sonra soğutma sisteminin açık olduğundan ve denemeyi başlatmadan önce dört dereceye ayarlandığını emin olun. Akış kanalı basınç regülatörüne uygulanan basınçların 800 milibar'a ayarlanıp yazılım kullanılarak ayarlanıp, her bir akış kanalının çıkış basıncını 20 ile 100 milibar arasında ayarlayıp ayarlamadığını kontrol edin.
Kontrol kanalı solenoid valflere uygulanan basınçların dokuzdan 29'a kadar kanallar için 1'den sekize kadar ve üç çubuklu kanallar için bir çubuk olup olmadığını kontrol edin. Ardından, kanal 29'a basınç basarak cihazın çıkışını kapatın ve aynı anda kontrol kanallarını 1'den 3'e ve 15'ten 28'e kadar basınçlandırma. Ardından, seçili tek bir reaktifin cihaza akmasına izin vermek için çoklayıcının kontrol kanallarını seçici olarak basınçtan arındırın.
Havanın uzaklaştırılmasını izlemek için mikroskobu kullanın ve daha sonra tüm reaktiflerin hava kabarcıkları çıkarmadan doğru şekilde akmasını sağlayın. Sağlanan yazılım paketini kullanarak, eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi kalibrasyon işlemiyle ilgili veri alanlarını ayarlayın. Daha sonra kalibrasyon protokolünü çalıştırarak tek bir giriş adımı nda her reaktörden çıkan sıvı hacmini belirleyin.
Kalibrasyon deneyinin analizini tamamlamak ve mikroakışkan cihazdaki her bir halka reaktörünün yenileme oranını belirlemek için kontrol yazılımı tarafından sunulan adımları takip edin. Son olarak, sanal denetim arabirimi içinde istenen deneme için gerekli değerleri ayarlayın. Denetim arabirimindeki deneme yap düğmesine basarak deneysel protokolü başlatın.
Bir kalibrasyon deneyi sırasında reaktörler, her seyreltmeden sonra yoğunluğu kaydedilen bir florofor ile doldurulur. Seyreltme başına floresan yoğunluğundaki azalma, belirlenen giriş adımlarında yer değiştiren reaktör halkasının hacmini ortaya çıkarır. Bu birim yenileme oranı olarak adlandırılır.
Ortalama yenileme oranı ve standart sapma kırmızı her seyreltme adımı için gösterilir. Sekiz reaktörden yedisi çok benzer davranışlar sergilerken, bir reaktör yedinci seyreltme döngüsünden sonra dalgalanmalar gösteriyor. Bu, her reaktörün benzersiz yenileme oranlarına duyulan ihtiyacı vurgular.
Burada gösterilen uzun süreli in vitro transkript ve çeviri reaksiyonu her 14.6 dakikada bir reaktör hacminin %30'una sahipti. Boşluk olarak kullanılan mikroakışkan cihazın iki reaktörü. Diğer tüm reaktörler in vitro transkripsiyon ve çeviri reaksiyon çözeltisi %75'ini ve ultra saf su veya 2,5 nanomolar lineer DNA şablonlarının %25'ini deGFP proteininin ekspresyonuna göre kodlayan lardan oluşuyordu.
DNA'nın eklendiği dört reaktörde de GFP ekspresyonu vardı. Bir reaktör daha düşük floresan sinyali gösterir. Bu, akıştaki eşitsizlikten kaynaklanabilir ve bu da reaktöre daha az DNA girmesiyle veya reaktör boyutlarındaki farklılıklara bağlı olarak ortaya çıkabilir.
14 saat sonra, DNA içeren reaktörlerin sinyalinde ani bir artış görülür. Bu mikroakışkan cihazın akış tabakası giren bir hava kabarcığı neden olur. Akışın yeniden başlamasıyla, deney önceki floresan yoğunluğuna geri döner.
Hücresiz reaksiyon çözümleri yeterince soğutulmadığı sürece zaman içinde bozulmaya maruz kalırlar, kritik öneme sahip bu protokolde açıklanan soğutma işlemini yaparlar. Platformun çok yönlülüğü nedeniyle, biyokimyasal ve kimyasal reaksiyonlar çeşitli hassas ve kontrollü bir şekilde yapılabilir. Mikroakışkan akış reaktörlerinin uygulanması, çift genetik devreprototipleme için art arda tasarım geliştirme test döngülerini hızlandırmıştır.
