Le prototypage des réseaux génétiques synthétiques est grandement amélioré par l’utilisation de systèmes d’expression génétique sans cellules. Notre protocole décrit le processus de fabrication du réacteur à flux microfluidique multicouche et montre qu’un tel dispositif peut être utilisé pour l’expression prolongée de GFP sans cellules. Les expressions protéiques sans cellules, combinées à des réacteurs à débit microfluidique, constituent la plate-forme de prototypage rapide pour la conception de dispositifs biologiques synthétiques.
Toute cette configuration est très polyvalente et peut être adaptée à la conduction de toutes les réactions biochimiques ou chimiques nécessitant des niveaux élevés de contrôle. Il est essentiel et difficile d’assurer la stabilité de la solution de réaction sans cellules. Assurez-vous de vous concentrer sur la fourniture d’un refroidissement suffisant et d’utiliser le tube spécifié dans ce protocole.
La fabrication et la préparation de la plate-forme expérimentale nécessitent la connexion de nombreux composants individuels, un processus qui peut être difficile à suivre sans aides visuelles. Pour commencer, suivez le protocole texte qui l’accompagne pour fabriquer l’appareil microfluidique et mettre en place le contrôle pneumatique et la régulation de la pression d’écoulement qui seront utilisés pour contrôler les valves essentielles à cet appareil. Pour configurer le refroidissement hors puce, commencez par encmenter une longueur de tube PTFE sur la face froide d’un élément Peltier et fixez la bobine avec du ruban adhésif.
Assurez-vous qu’une extrémité du tube PTFE est reliée aux réservoirs du système de contrôle de la pression de la couche d’écoulement et que l’autre extrémité ne dépasse pas un centimètre de la surface Peltier. Ensuite, insérez une longueur de cinq à 10 centimètres de tube PEEK dans l’extrémité saillante du tube PTFE. Appliquer une quantité suffisante de composé thermique sur la face chaude de l’élément Peltier et le placer sur la plaque froide du bloc d’eau.
Assurez-vous que le tube, l’élément Peltier et le bloc de refroidissement sont en contact direct les uns avec les autres en tout temps. Ensuite, connectez l’élément Peltier au contrôleur de température à l’aide d’un connecteur de bus en série afin que la tension fournie au Peltier puisse être régulée. Ensuite, placez solidement un thermistor sur la surface Peltier et connectez sa sortie au contrôleur de température.
Après avoir activé le refroidisseur d’eau, adaptez la tension fournie au Peltier jusqu’à ce que la température soit stable à quatre degrés Celsius. Pour chaque canal de commande de l’appareil microfluidique couper une longueur de tube standard qui est d’un mètre de long. À une extrémité, insérez la goupille d’une jauge 23, d’un talon Luer d’un demi-pouce et, à l’autre extrémité, insérez une goupille de raccordement en acier inoxydable.
Connectez le talon Luer à un connecteur en nylon barbelé mâle Luer de 3/32 pouces et insérez la barbe du connecteur dans une longueur de tube en polyuréthane. Insérez ensuite ce tube en polyuréthane directement dans l’une des valves solénoïdes. Ensuite, fixez un talon Luer de 23 jauges d’un demi-pouce à une seringue et insérez-le dans un morceau de tube standard de trois à quatre centimètres de long.
Placez l’extrémité ouverte de ce tube dans un réservoir d’eau ultra pure et remplissez la seringue d’eau ultra pure. Numérotez chaque canal de commande de l’appareil microfluidique comme indiqué ici. Pour les canaux 4 à 29, trouvez le tube correspondant et insérez la goupille métallique dans l’extrémité ouverte du tube fixé à la seringue.
Injectez ensuite de l’eau dans le canal de commande jusqu’à ce que la moitié de la longueur ait été remplie. Ensuite, déconnectez le tube de la seringue et insérez la goupille du connecteur en acier inoxydable dans le trou correspondant de l’appareil microfluidique. Répétez cette étape pour tous les canaux de contrôle.
Maintenant, utilisez l’interface de commande pour ouvrir toutes les valves solénoïdes. Cela va pressuriser le fluide dans le canal de commande tube le forçant dans le dispositif microfluidique et la fermeture de toutes les valves à base de membranes à l’intérieur de l’appareil. Pour chacun des reagents non cooled couper une longueur de mètre de tube standard pour connecter la sortie du réservoir aux entrées de périphérique microfluidique.
Prenez une extrémité du tube et insérez-la dans le réservoir pour vous assurer que le tube atteint la base du réservoir. La sortie de tubes du réservoir doit être resserré afin qu’un joint hermétique soit atteint. Ensuite, insérez une goupille de raccordement inoxydable dans l’extrémité ouverte du tube.
Ensuite, fixez un talon Luer de 23 jauges d’un demi-pouce à l’extrémité d’une seringue d’un millilitre. Ajoutez une courte longueur de tube standard au talon Luer. Placez l’extrémité du tube dans la solution de reagent désirée et remplissez la seringue avec le reagent.
Insérez ensuite la goupille du connecteur en acier inoxydable dans le tube en polyuréthane relié à la seringue et remplissez le tube avec le reagent. Lors de l’utilisation de petits volumes de réaction, le reagent n’entrera pas dans le réservoir et le tube lui-même agira comme réservoir. Une fois terminée, déconnecter la seringue et insérer la goupille du connecteur dans l’un des trous d’entrée de la couche d’écoulement de l’appareil microfluidique.
Appliquez ensuite une pression sur chacun des réservoirs à l’aide du logiciel de régulateur de pression pour forcer les réadiants à entrer dans l’appareil microfluidique. Assurez-vous que le refroidisseur d’eau et les éléments Peltier ont été activés avec la température de surface du Peltier réglée à quatre degrés Celsius. Montez la configuration de refroidissement aussi près que possible de l’appareil microfluidique afin de minimiser le volume non refroidi entre le Peltier et l’entrée de l’appareil.
Ensuite, connectez celui de la seringue d’un millilitre à un talon Luer de 23 jauges d’un demi-pouce avec une courte longueur de tube standard fixée à l’extrémité. Dessinez dans le reagent à refroidir pour remplir la seringue. Ensuite, connectez le tube PEEK à la seringue par le tube conjonctif et appliquez une pression constante sur la seringue forçant le reagent à travers le tube PEEK et dans le tube PTFE.
Débranchez enfin le tube PEEK de la seringue et insérez-le directement dans les entrées du canal d’écoulement de l’appareil microfluidique. Lorsque la pression est appliquée, le reagent refroidi sera forcé dans le dispositif microfluidique. Assurez-vous que le dispositif microfluidique est fixé sur la scène du microscope avec tous les tubes de commande et de couche d’écoulement attachés et fermez toutes les ouvertures sur l’incubateur.
Ensuite, réglez la température ambiante de l’incubateur à 29 degrés Celsius. Ensuite, assurez-vous que le système de refroidissement a été allumé et est réglé à quatre degrés Celsius avant le début de l’expérience. Vérifiez que les pressions appliquées au régulateur de pression du canal d’écoulement sont réglées à 800 millibar et à l’aide du logiciel, réglez la pression de sortie de chaque canal de flux individuel entre 20 et 100 millibar.
Vérifiez que les pressions exercées sur les valves solénoïdes du canal de commande sont une barre pour les canaux une à huit et trois barres pour les canaux neuf à 29. Ensuite, fermez la prise de l’appareil en pressurisant le canal 29 et dépressurisez simultanément les canaux de commande un à trois et de 15 à 28. Dépressurisez ensuite sélectivement les canaux de commande du multiplexeur pour permettre à un seul réaccérateur sélectionné de s’écouler dans l’appareil.
Utilisez le microscope pour surveiller l’élimination de l’air et par la suite s’assurer que tous les reagents circulent correctement sans introduire de bulles d’air. À l’aide du logiciel fourni, configurer les champs de données liés au processus d’étalonnage décrits dans le protocole texte qui l’accompagne. Déterminez ensuite le volume de liquide déplacé de chaque réacteur au cours d’une seule étape d’entrée en exécutant le protocole d’étalonnage.
Suivez les étapes présentées par le logiciel de contrôle pour compléter l’analyse de l’expérience d’étalonnage et déterminer le rapport de rafraîchissement de chaque réacteur à terminaisons dans le dispositif microfluidique. Enfin, définissez les valeurs requises pour l’expérience souhaitée dans l’interface de contrôle virtuel. Lancez le protocole expérimental en appuyant sur le bouton d’expérience perform dans l’interface de contrôle.
Au cours d’une expérience d’étalonnage, les réacteurs sont remplis d’un fluorophore dont l’intensité est enregistrée après chaque dilution. La diminution de l’intensité de fluorescence par dilution révèle le volume de l’anneau du réacteur déplacé pour le nombre défini d’étapes d’entrée. Ce volume est appelé le rapport de rafraîchissement.
Le rapport de rafraîchissement moyen et l’écart type sont indiqués pour chaque étape de dilution en rouge. Sept des huit réacteurs présentent un comportement très similaire, mais un réacteur montre des fluctuations après le septième cycle de dilution. Cela met en évidence la nécessité de ratios de rafraîchissement uniques pour chacun des réacteurs.
La transcription in vitro prolongée et la réaction de traduction montrée ici ont eu 30% du volume de réacteur déplacé toutes les 14.6 minutes. Deux réacteurs de l’appareil microfluidique lorsqu’il est utilisé comme blancs. Tous les autres réacteurs comprenaient 75% de solution de transcription in vitro et de réaction de traduction et 25% d’eau ultra pure ou 2,5 modèles d’ADN linéaire nanomolaire codant pour l’expression de la protéine deGFP.
Dans les quatre réacteurs où l’ADN a été ajouté, il y avait une expression claire deGFP. Un réacteur affiche un signal de fluorescence plus faible. Cela pourrait être causé par une disparité de débit entraînant une réduction de l’ADN entrant dans le réacteur ou par des variations dans les dimensions du réacteur.
Après 14 heures, une augmentation soudaine est observée dans le signal des réacteurs contenant de l’ADN. Ceci est causé par une bulle d’air entrant dans la couche d’écoulement du dispositif microfluidique. À la reprise du flux, l’expérience revient à son intensité de fluorescence précédente.
Les solutions de réaction sans cellules sont sujettes à dégradation au fil du temps à moins qu’elles ne soient suffisamment refroidies, ce qui rend le processus de refroidissement décrit dans ce protocole d’une importance critique. En raison de la polyvalence de la plate-forme, une variété de réactions biochimiques et chimiques peuvent être menées d’une manière précise et contrôlée. L’application de réacteurs à débit microfluidique a accéléré les cycles successifs d’essai de conception pour le prototypage des doubles circuits génétiques.
