合成遺伝子ネットワークのプロトタイピングは、無細胞遺伝子発現システムの使用により大幅に改善されています。我々のプロトコルは、多層マイクロ流体流動反応器の製造プロセスを記述し、そのような装置がGFPの長期無細胞発現に使用できることを示している。マイクロ流体フローリアクターと組み合わせた無細胞タンパク質表現は、合成生物学的デバイスの設計のための迅速なプロトタイピングプラットフォームを提供します。
この全体のセットアップは非常に多目的であり、制御の高いレベルを必要とする任意の生化学的または化学反応の伝導に適合することができる。無細胞反応溶液の安定性を確保することは重要であり、達成することは困難である。十分な冷却を提供することに焦点を当て、このプロトコルで指定されたチューブを利用してください。
実験プラットフォームの製造および準備には、多数の個々のコンポーネントの接続が必要であり、視覚補助なしで従うのが困難なプロセスである。まず、付属のテキストプロトコルに従ってマイクロ流体デバイスを製造し、このデバイスに重要なバルブを制御するために使用される空気圧制御および流圧調節を設定します。オフチップ冷却を設定するには、まず PTFE チューブの長さをペルチェ要素の冷たい面に巻き付け、テープでコイルを固定します。
PTFEチューブの一方の端がフロー層の圧力制御システムの貯留層に接続され、もう一方の端がペルチェ表面から1センチメートル以下に突き出していることを確認します。次に、PTFEチューブの突出先にPEEKチューブの5〜10センチメートルの長さを挿入します。ペルチェ元素の熱い面に十分な量の熱化合物を塗布し、水ブロックの冷たいプレートに置きます。
チューブ、ペルチェ要素、冷却ブロックが常に相互に直接接触していることを確認します。次に、ペルチェに供給される電圧を調整できるように、シリアルバスコネクタを使用してペルチェ素子を温度コントローラに接続します。その後、ペルチェ表面にサーミスタをしっかりと配置し、その出力を温度コントローラに接続します。
水クーラーをオンにした後、温度が摂氏4度で安定するまでペルチェに供給される電圧を適合させます。マイクロ流体デバイスの各制御チャネルのために、長さ1メートルの標準的な管の長さをカット。一方の端に、23ゲージのピン、1つの半インチのルアースタブを挿入し、もう一方の端にステンレス製の接続ピンを挿入します。
ルアースタブをオスのLuer 3/32インチの有刺鉄線ナイロンコネクタに接続し、コネクタのバーブをポリウレタンチューブの長さに挿入します。次に、このポリウレタンチューブをソレノイドバルブの1つに直接挿入します。次に、23ゲージの半インチルアースタブを注射器に取り付け、これを3〜4センチメートルの標準チューブに挿入します。
このチューブのオープンエンドを超純水の貯水池に入れ、注射器に超純水を充填します。ここに示すようにマイクロ流体デバイスの各制御チャネルに番号を付けます。チャンネル 4 ~ 29 の場合、対応するチューブを探し、シリンジに取り付けられたチューブの開いた端に金属ピンを挿入します。
その後、半分の長さが満たされるまで、コントロールチャネルチューブに水を注入します。次に、注射器からチューブを取り外し、ステンレス製のコネクタピンをマイクロ流体装置の対応する穴に挿入します。すべてのコントロール チャネルに対してこの手順を繰り返します。
今、コントロールインターフェイスを使用して、ソレノイドバルブのすべてを開きます。これは、制御チャネルチューブ内の流体を加圧し、マイクロ流体装置に押し込み、デバイス内のすべての膜ベースのバルブを閉じます。各非冷却試薬のためにマイクロ流体装置の入口に貯蔵出口を接続するために標準的な管のメートルの長さを切った。
チューブの一端を取り、これを貯水池に挿入して、チューブが貯水池の底部に到達することを確認します。気密シールが得られるように、貯留槽の出口を締め付ける必要があります。次に、チューブの開いた端にステンレス接続ピンを挿入します。
次に、1ミリリットルのシリンジの端に23ゲージの半インチルアースタブを取り付けます。Luer スタブに標準チューブの短い長さを追加します。チューブの端を目的の試薬溶液に入れ、注射器に試薬を充填します。
次に、ステンレス製のコネクタピンをシリンジに接続されたポリウレタンチューブに挿入し、試薬でチューブを充填します。少量の反応量を使用する場合、試薬はリザーバに入らず、チューブ自体がリザーバーとして機能します。完了したら、シリンジを取り外し、マイクロ流体デバイスのフロー層の入口穴の1つにコネクタピンを挿入します。
次に、圧力調整ソフトウェアを使用して各リザーバに圧力をかけ、試薬をマイクロ流体デバイスに強制的に入れ加えます。ペルチェの表面温度を摂氏4度に設定して、水冷器とペルチェ元素をオンにします。冷却セットアップをマイクロ流体デバイスにできるだけ近づけて、ペルチェとデバイスの入口の間の冷却されていないボリュームを最小限に抑えます。
その後、1ミリリットルのシリンジを23ゲージの半インチのルアースタブに接続し、短い長さの標準チューブを端に取り付けます。冷却される試薬を注射器に充填するために引き込む。次に、接続チューブを介してPEEKチューブをシリンジに接続し、PEEKチューブを介して試薬をPTFEチューブに強制する注射器に一定の圧力を加えます。
最後に、PEEKチューブをシリンジから切り離し、マイクロ流体デバイスの流路入口に直接挿入します。圧力が加えられると、冷却された試薬はマイクロ流体装置に強制されます。マイクロ流体デバイスが、すべての制御およびフロー層チューブを取り付けた顕微鏡ステージで安全であることを確認し、インキュベーター上の開口部を閉じます。
次に、インキュベーターの周囲温度を摂氏29度に設定します。次に、冷却システムがオンになっており、実験を行う前に摂氏4度に設定されていることを確認します。流路圧力調整器に加えられる圧力が800ミリバールに設定されていることを確認し、ソフトウェアを使用して、個々の流路の出力圧力を20~100ミリバールに設定します。
制御チャネルソレノイドバルブに適用される圧力が、チャンネル1~8の1バーと、チャンネル9~29の3つのバーであることを確認します。次に、チャネル29を加圧して装置の出口を閉じ、同時に制御チャネル1から3および15〜28を減圧する。次に、マルチプレクサの制御チャネルを選択的に減圧して、選択した1つの試薬がデバイスに流れ込むことを可能にする。
顕微鏡を使用して空気の除去を監視し、その後、すべての試薬が気泡を導入することなく正しく流れるようにします。付属のソフトウェアパッケージを使用して、付属のテキストプロトコルに記載されているように、キャリブレーションプロセスに関連するデータフィールドを設定します。続いて、キャリブレーションプロトコルを実行することにより、単一流入工程中に各反応器から変位する流体体積を決定する。
制御ソフトウェアによって提示された手順に従って、キャリブレーション実験の分析を完了し、マイクロ流体装置内の各リングリアクタのリフレッシュ比を決定します。最後に、仮想コントロール インターフェイス内で目的の実験に必要な値を設定します。制御インターフェースの実験実行ボタンを押して実験プロトコルを開始します。
キャリブレーション実験中に、反応器は各希釈後に強度が記録される蛍光色素で満たされます。希釈あたりの蛍光強度の低下は、設定された流入ステップ数に対して変位する原子炉リングの体積を明らかにする。このボリュームは、リフレッシュ率と呼びます。
各希釈ステップの平均リフレッシュ比と標準偏差は赤で示されています。8基の原子炉のうち7基は非常によく似た振る舞いを示すが、1基の原子炉は7回目の希釈サイクル後の変動を示す。これにより、各リアクタの一意のリフレッシュ比の必要性が強調されます。
ここに示す長時間のin vitro転写および翻訳反応は、14.6分ごとに30%の反応器容積が変位した。ブランクとして使用されるマイクロ流体装置の2つの反応器。他のすべての反応器は、75%のインビトロ転写および翻訳反応溶液と、deGFPタンパク質の発現をコードする超純水または2.5ナノモル線形DNAテンプレートの25%で構成された。
DNAが添加された4つの原子炉すべてにおいて、明確なdeGFP発現があった。1つの反応器は、より低い蛍光信号を表示する。これは、フローの不均一化により、反応器に入るDNAが少なくなるか、原子炉の寸法のばらつきが原因である可能性があります。
14時間後、DNAを含む反応器のシグナルに急激な増加が見られる。これは、マイクロ流体装置の流れ層に入る気泡によって引き起こされる。流れの再開時に、実験は以前の蛍光強度に戻る。
無細胞反応溶液は、十分に冷却されない限り経時的に劣化を受け、このプロトコルに記載された冷却プロセスを極めて重要なものにする。プラットフォームの汎用性のために、様々な生化学的および化学反応を正確かつ制御された方法で行うことができます。マイクロ流体流動反応器の適用は二重の遺伝子回路のプロトタイプの連続的な設計のテスト周期を加速した。
