الهدف العام لهذا البروتوكول هو قياس BK-polyomavirus غير الترميز التحكم في المنطقة يحركها نشاط النسخ عن طريق قياس الخلايا الفلورية المزدوجة عن طريق تدفق الخلايا. يمكن أن يسبب فيروس BK-polyoma أمراضًا شديدة في المرضى الذين يعانون من المناعة ، وخاصة في متلقي زراعة الكلى. ومع ذلك، بما أن مكافحة الفيروسات عالية الفعالية غير متوفرة حاليًا، فإن الطرق التي تقيس التأثير المحتمل لمكافحة الفيروسات للمركبات الأخرى مطلوبة.
تسمح هذه الطريقة لعلماء الفيروسات بتحليل تأثير العوامل المضادة للفيروسات المحتملة التي تؤثر على نشاط النسخ النسخي لفيروس BK-polyomaal الذي تحركه منطقة التحكم غير الترميزية. ويسمح هذا الفحص كذلك بدراسة تأثير إعادة الترتيب على نشاط المروج مقارنة بمناطق التحكم غير الترميزية. وميزة دراسة نشاط المروج الفيروسي مع تقرير الفلوريسين المزدوج هو أنه يمكن تحليل التعبير الجيني المبكر والمتأخر بطريقة مستقلة بشكل متبادل.
وعلاوة على ذلك، فإن ثقب الصعب من مخزونات الفيروس والتجارب على المدى الطويل ثقافة الخلايا المعدية ليست ضرورية لأنه يتم تحليل الخلايا المصابة فقط وفلورسنت، كما يمكن دراسة الأدوية الحد من صلاحية الخلية وثقب. يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للبحوث البشرية كما وافقت عليها لجنة الأخلاقيات في كلية الطب في جامعة دويسبورغ إيسن. الخطوة الأولى هي جمع عينات الدم لعزل الحمض النووي لفيروس الورم المتعدد.
جمع ما لا يقل عن ثلاثة ملليلتر من الدم في أنابيب اقتناء EDTA. الطرد المركزي العينة في 2, 500 G لمدة 15 دقيقة والماصات البلازما في أنبوب جديد. إعداد 40 ميكرولترات من البروتين SK في أنبوب 1.5 ملليلتر أجهزة الطرد المركزي الصغيرة وإضافة البلازما 400 ميكروليتر عن طريق الأنابيب.
عزل الحمض النووي باستخدام مجموعة استخلاص لطخة الحمض النووي كما هو موضح في تعليمات الشركة المصنعة. إعداد مزيج الرئيسي ل PCR قبل استخدام زوج التمهيدي A في حجم إجمالي 50 ميكرولترات واستخدام الحمض النووي المعزول سابقا. توزيع 45 ميكروليتر من المزيج الرئيسي في أنابيب PCR.
إضافة خمسة ميكرولترات من الحمض النووي المعزول في أنابيب PCR وتشغيل PCR مع ظروف رد الفعل كما هو موضح في الجدول الثالث. كرر الوَحن والامتداد في 35 دورة. للتطبيق المتداخل، استخدم زوج التمهيدي B، مع تضمين مواقع التقييد للاستنساخ.
مزيج 10 ميكرولترات من المنتج PCR مع اثنين microliters من ستة أضعاف هلام تحميل صبغة. تحميل 10 ميكرولترات من هذا المزيج على 1.5٪ agarose هلام وتشغيل الجل لمدة 30 دقيقة في 60 milliampere. تصور الجل باستخدام نظام توثيق الأشعة فوق البنفسجية المناسبة.
تنقية تضخيم PCR باستخدام مجموعة تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استوعب أمبلونات المنقى مع إنزيمات تقييد المؤشر لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. كرر خطوات تنقية لتنقية أمبليكونات هضمها.
في موازاة ذلك ، هضم أيضا العمود الفقري البلازمي. تحليل العمود الفقري البلازميد هضم على 0.8٪ منخفضة جبل agarose هلام. لا تقم بتشغيل الجل في تيار أعلى من 40 مللي أمبير.
تصور شظايا الحمض النووي باستخدام موجة طويلة من الأشعة فوق البنفسجية وقطع عازمة العمود الفقري باستخدام مشرط نظيفة. تجنب التعرض للأشعة فوق البنفسجية الطويلة لأوقات لمنع تلف الحمض النووي. سياج لقطعة من هلام flomel جزء جديد 1.5 ملليلتر أنبوب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة.
سخني العمود الفقري الذي يحتوي على قطعة agarose منخفضة الوضع لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية من أجل إذابة قطعة الجل وخلط كل دقيقتين من قبل دوامة لطيف. يمكن استخدام الجل المذاب مباشرة في الربط. ليغيت العمود الفقري و amplicon هضم باستخدام T4 الحمض النووي ligase بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.
بعد إجراء الاستنساخ القياسية، عزل الحمض النووي البلازما. أداء هضم الانزيم تقييد للتحقق من استنساخ إيجابية وتصور شظايا هضم على هلام agarose 1٪. البذور 100، 000 خلايا HEK293T في بئر من 12 بئر لوحة 24 ساعة قبل transfection واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، والحفاظ على الانتشار النشط أثناء transfection.
يجب أن تكون الخلايا تقريبا في 80٪ التقاء في transfection. ضع 250 ميكرولترات من وسائل الإعلام المصلية المخفضة في أنبوب معقمة وأضف ميكروغرام واحد من كل حمض نووي البلازما المبلغ عنه واخلط بلطف عن طريق الأنابيب. إضافة ثلاثة ميكرولترات من كاشف transfection إلى خليط الحمض النووي ويخلط بلطف عن طريق الأنابيب واحتضان لمدة 15 دقيقة في 22 درجة مئوية.
يُضاف الخليط، ويُسقط من الحكمة إلى البئر ويُوزّع بلطف على البئر. بعد أربع ساعات، استبدل المابير بوسيط جديد يحتوي على عوامل الاختبار والتحكم بالمذيبات. في هذا المثال، تم استخدام مثبطات mTOR INK-128 و rapamycin.
احتضان في 37 درجة مئوية حتى التحليل. تحقق من الخلايا من الفلورس الأحمر والأخضر تحت مجهر الفلوريسين. الفلورس الأحمر والأخضر تتوافق مع التعبير الجيني BK-polyomavirus في وقت مبكر وأواخر على التوالي.
72 ساعة بعد transfection ، نطمح بعناية فائقة. غسل الخلايا مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني الباردة. أضف بلطف 500 ميكرولترات التربسين وتحويل لوحة قليلا لتجنب انفصال سابق لأوانه من الخلايا.
هذه الخطوة هامة لتجنب doublets الخلية. بعد إضافة, تتم إزالة التربسين مباشرة مع نفس تلميح ماصة. احتضان الخلايا لمدة خمس دقائق على الأقل في 37 درجة مئوية.
إعادة تعليق الخلايا التربسين S مع برنامج تلفزيوني ملليلتر واحد يحتوي على 3٪ FCS ونقل التعليق في أنابيب FACS المسمى مسبقا. يضاف DAPI بتركيز ميكروغرام واحد لكل ملليلتر قبل تحليل FACS. تحليل الخلايا باستخدام مقياس تدفق الخلايا.
لكل عينة، قياس ما لا يقل عن 10،000 الخلايا الحية. التعويض الأولي ضروري للتمييز بين الإشارات الحمراء والخضراء لتحقيق نتائج دقيقة. تم تضخيم ريجنت التحكم غير الترميز باستخدام بروتوكول PCR متداخلة باستخدام زوج التمهيدي الداخلي الذي يضم مواقع تقييد الاستنساخ.
تم إجراء التحقق من أمبيرليكون عن طريق electrophoresis هلام agarose بينما امبريكون المستمدة من تسلسل NCCR النمطية في توزيع حجم متجانس في الجل، تلك المستمدة من NCCRs إعادة ترتيبها مع الإدراج والحذف، تختلف في حجمها. وتم التحقق من اختيار النسخ الموجبة التي تحتوي على اللجنة الوطنية المعنية بالكرات والاخاءات بواسطة تحليل القيود. تم استبدال منطقة المساحة الصغيرة بشظايا NCCR أكبر تشير إلى استنساخ إيجابي.
تم إرسال الحمض النووي Plasmid معزولة عن استنساخ التحقق من ل pyrosequencing. في هذا المثال، تم الكشف عن الحذف في كتلة P و الاستبدال في كتلة O. وقد تم إصابة خلايا HEK293T بشكل عابر مع احترام البناء القابلة للإبلاغ وتم رصد نشاط NCCR بواسطة مجهر الفلورس.
تطابقت الفلورسنتات الحمراء والأخضر مع التعبير الجيني لفيروس BK-polyoma في وقت مبكر وأواخر على التوالي. عرضت اللجنة الوطنية الأولى التعبير الجيني المتأخر القوي في حين كان المثال الثاني قوي نسبياً في وقت مبكر ولكن معتدل من التعبير الجيني. تم اغدخل الخلايا السلبية DAPI وتم إنشاء مؤامرة نقطة تظهر eGFP مقابل tdTomato.
وقد أدرجت في التحليل عينات كانت سلبية وكذلك تلك العينات الإيجابية لـ tdTomato أو eGFP. تم اشتقاق شدة الفلورس المتوسط من كل استنساخ اختبار. في هذا المثال، والعلاج مع مثبطات MTOR المزدوج INK128 خفضت بشكل كبير tdTomato MFI مما يعني أن التعبير المبكر تم تثبيط.
تسمح هذه الطريقة لتحديد المركبات المستخدمة حاليًا وغيرها من المركبات للكشف عن فيروس BK-polyomavirus من خلال النشاط النسخي. في التعبير الجيني المبكر ، وهذا يحدد بالتأكيد الآثار الفيروسية. ويمكن اعتبار قطرات المثبطة لاستخدامها وكلاء للمرضى المناعيين في حالة إعادة تنشيط فيروس الورم البولي BK.
