המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא למדוד BK-polyomavirus אזור בקרת אי קידוד מונע פעילות שעתוק על ידי מדידת תאים פלואורסצנטיים כפולים באמצעות ציטומטריית זרימה. BK-polyomavirus יכול לגרום פתולוגיות חמורות בחולים immunocompromised, במיוחד אצל מושתלי כליות. עם זאת, מאז אנטי וירוס יעיל מאוד אינם זמינים כיום, שיטות מדידת ההשפעה האנטי ויראלית הפוטנציאלית של תרכובות אחרות נדרשים.
שיטה זו מאפשרת לווירולוגים לנתח את ההשפעה של סוכנים אנטי ויראליים פוטנציאליים המשפיעים על פעילות שעתוק BK-polyomavirus המונעת על ידי אזור הבקרה שאינו קידוד. בדיקה זו מאפשרת עוד יותר לחקור את ההשפעה של סידורים מחדש על פעילות האמרגן בהשוואה לאזורי בקרה ארכיטיפיים שאינם קידוד. היתרון של לימוד פעילות האמרגן הוויראלי עם דו"ח פלואורסצנטי כפול הוא שניתן לנתח ביטוי גנים מוקדם ומאוחר באופן עצמאי הדדי.
יתר על כן, ניקוב קשה של מניות וירוסים וניסויים ארוכי טווח בתרבות תאים זיהומיות אינם נחוצים שכן רק תאים מדבקים ופלורסנט מנותחים, גם תרופות המפחיתות את הכדאיות של התאים וניקוב ניתן ללמוד. פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות המחקר האנושי כפי שאושרו על ידי ועדת האתיקה של הפקולטה הרפואית של אוניברסיטת דואיסבורג-אסן. הצעד הראשון הוא לאסוף דגימות דם לבידוד של דנ"א פוליו-וירוס.
לאסוף לפחות שלושה מיליליטר של דם בצינורות רכישת EDTA. צנטריפוגה המדגם ב 2, 500 G במשך 15 דקות ו pipette הפלזמה לתוך צינור חדש. הכינו 40 מיקרוליטרים של חלבון SK לצינור מיקרו-צנטריפוגה בגודל 1.5 מיליליטר והוסיפו 400 מיקרוליטר פלזמה על ידי צינורות.
לבודד את ה-DNA באמצעות ערכת מיצוי כתם DNA כמתואר בהוראות היצרן. הכינו את התערובת הראשית לקדם-PCR באמצעות זוג פריימר A בנפח כולל של 50 מיקרוליטרים ולהשתמש בדנ"א המבודד בעבר. הפץ 45 מיקרוליטרים של התערובת הראשית לתוך צינורות PCR.
הוסף חמישה microliters של DNA מבודד לתוך צינורות PCR ולהפעיל את PCR עם תנאי התגובה כפי שמודגם בטבלה שלוש. חזור על חישול denaturation והרחבה ב 35 מחזורים. עבור יישום מקונן, השתמש בזוג פריימר B, המטפח את אתרי ההגבלה לשיבוט.
מערבבים 10 מיקרוליטרים של מוצר PCR עם שני מיקרוליטרים של צבע טעינת ג'ל פי שישה. טוענים 10 מיקרוליטרים של התערובת על ג'ל 1.5% agarose ולהפעיל את הג'ל במשך 30 דקות ב 60 מיליאמפר. דמיינו את הג'ל בעזרת מערכת תיעוד UV מתאימה.
לטהר את אמפיליקונים PCR באמצעות ערכת טיהור PCR בהתאם להוראות היצרן. לעכל את amplicons מטוהרים עם אנזימי הגבלת מחוון במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס. חזור על שלבי הטיהור כדי לטהר את האמפליקונים המתעכלים.
במקביל, גם לעכל את עמוד השדרה פלסמיד. לנתח את עמוד השדרה פלסמיד מתעכל על 0.8% הר נמוך ג'ל אגרוז. אין להפעיל את הג'ל בזרם גבוה יותר מ-40 מיליאמפר.
דמיינו שברי דנ"א בעזרת אור UV בגל ארוך וחתכו את עמוד השדרה כפוף באמצעות אזמל נקי. יש להימנע פעמים ארוכות מחשיפה לקרינת UV כדי למנוע נזק לדנ"א. גדר לחתיכת שבר ג'ל פלומל לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה חדש 1.5 מיליליטר.
מחממים את עמוד השדרה המכיל חתיכת אגרוז במצב נמוך במשך 10 דקות ב 65 מעלות צלזיוס על מנת להמיס את חתיכת הג'ל ומערבבים כל שתי דקות על ידי מערבולת עדינה. ג'ל מומס יכול לשמש ישירות עבור קשירה. עמוד השדרה של Ligate והאמפליקון המתעכל באמצעות ליגת ה-DNA T4 למשך הלילה ב-16 מעלות צלזיוס.
לאחר הליך שיבוט סטנדרטי, לבודד את ה-DNA פלזמה. בצע עיכול אנזים הגבלה כדי לבדוק שיבוטים חיוביים לדמיין שברים מתעכלים על 1%agarose ג'ל. זרעים 100, 000 HEK293T תאים לכל באר של 12 צלחת באר 24 שעות לפני transfection ודגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס, לשמור על התפשטות פעילה במהלך transfection.
התאים צריכים להיות בערך ב-80%confluency בעת ביצוע חילוף. מניחים 250 microliters של מדיה סרום מופחת בצינור סטרילי ולהוסיף מיקרוגרם אחד של כל DNA פלזמה דיווח לערבב בעדינות על ידי צינורות. מוסיפים שלושה מיקרוליטרים של רגנט ההטרמפקט לתערובת הדנ"א ומערבבים בעדינות על ידי צינורות ודגירה במשך 15 דקות ב-22 מעלות צלזיוס.
מוסיפים את התערובת, טיפה חכם לגם בעדינות להפיץ לגם. לאחר ארבע שעות, החלף את העל-טבעי במדיום טרי המכיל את סוכני הבדיקה ואת בקרת הממסים. בדוגמה זו, מעכבי mTOR INK-128 ו rapamycin שימשו.
דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עד ניתוח. בדוק תאים עבור פלואורסצנטיות אדומה וירוקה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פלואורסצנטיות אדומה וירוקה תואמת את ביטוי הגן BK-polyomavirus המוקדם והמאוחר בהתאמה.
72 שעות לאחר ההתעלות, בזהירות לשאוף את supernatant. לשטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS קר. מוסיפים בעדינות 500 מיקרוליטרים ומסובבים מעט את הצלחת כדי למנוע ניתוק מוקדם של התאים.
שלב זה חשוב כדי למנוע כפילומות תאים. לאחר הוספת, טריפסין מוסר ישירות עם אותו טיפ פיפטה. דגירה התאים לפחות חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
השהה מחדש את תאי טריפסין S עם PBS מיליליטר אחד המכיל 3%FCS והעבר את ההשעיה בצינורות FACS עם תווית מראש. הוסף DAPI בריכוז של מיקרוגרם אחד למיליליטר לפני ניתוח FACS. לנתח את התאים באמצעות ציטומטר זרימה.
עבור כל מדגם, למדוד לפחות 10,000 תאים חיים. פיצוי ראשוני חיוני כדי להבחין אותות אדומים וירוקים כדי להשיג תוצאות מדויקות. מנהל הבקרה שאינו קידוד הוגבר באמצעות פרוטוקול PCR מקונן באמצעות זוג פריימר הפנימי אשר מחסה אתרי ההגבלה לשיבוט.
אימות האמפליקון בוצע באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז בעוד שהאמפליקונים שמקורם ברצפי NCCR ארכיטיפיים בחלוקת גודל הומופובית בג'ל, אלה שמקורם ב- NCCRs מסודרים מחדש עם הכנסות ומחיקות, היו שונים בגודלם. בחירת שיבוטים חיוביים המכילים את NCCR אומתה על-ידי ניתוח הגבלה. אזור הרווח הקטן הוחלף על-ידי שברי NCCR גדולים יותר המציינים שיבוטים חיוביים.
דנ"א פלסמיד מבודד משבבוטים מאומתים נשלחו לפירוזקווינקינג. בדוגמה זו זוהתה המחיקה בבלוק P וההחלפה בבלוק O. תאי HEK293T נותפו באופן ארעי עם הכבוד לבנייה הניתנת לדיווח ופעילות NCCR הייתה במעקב על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
פלואורסצנטיים אדומים וירוקים התאים לביטוי גנים BK-polyomavirus מוקדם ומאוחר בהתאמה. NCCR הראשון הציג ביטוי גנים מאוחר חזק בעוד הדוגמה השנייה היה חזק יחסית מוקדם אך מתון ביטוי גנים מאוחר. תאים שליליים DAPI היו מגודרים ועלילה נקודה נוצרה מראה eGFP לעומת tdTomato.
דגימות שהיו שליליות, כמו גם אלה חיוביים עבור tdTomato או eGFP נכללו רק לתוך הניתוח. התעצמויות פלואורסצנטיות ממוצעות נגזרו מכל שיבוט בדיקה. בדוגמה זו, הטיפול עם מעכב mTOR כפול INK128 מופחת באופן משמעותי tdTomato MFI כלומר ביטוי מוקדם היה מעוכב.
שיטה זו מאפשרת לזהות תרכובות בשימוש כיום ותרכובות אחרות כדי לזהות את BK-polyomavirus באמצעות פעילות שעתוק. בביטוי גנים מוקדם, זה בהחלט קובע את המשמעות הנגיפית. טיפות מעכבות עשוי להיחשב לשמש כסוכנים עבור חולים immunocompromised במקרה של הפעלה מחדש של BK-polyomavirus.
