O objetivo geral deste protocolo é medir a atividade transcricional baseada na região de controle de não codificação BK-polyomavirus, medindo células fluorescentes duplas através da citometria de fluxo. O BK-poliomavírus pode causar patologias graves em pacientes imunocomprometidos, especialmente em receptores de transplante renal. No entanto, como o antivírus altamente eficaz não está disponível no momento, são necessários métodos que medem o potencial impacto antiviral de outros compostos.
Este método permite que os virologistas analisem o impacto de potenciais agentes antivirais que afetam a atividade transcricional BK-poliomavírus impulsionada pela região de controle de não codificação. Este ensaio permite ainda estudar a influência dos rearranjos na atividade do promotor em comparação com regiões arquetípicas de controle não codificação. A vantagem de estudar a atividade de promotor viral com um relatório de fluorescência dupla é que a expressão genética precoce e tardia pode ser analisada de forma mutuamente independente.
Além disso, a difícil perfuração de estoques de vírus e experimentos de cultura de células infecciosas de longo prazo não são necessárias, uma vez que apenas células transfeinadas e fluorescentes são analisadas, também drogas que reduzem a viabilidade celular e a perfuração podem ser estudadas. Este protocolo segue as diretrizes da pesquisa humana aprovadas pelo comitê de ética da faculdade de medicina da Universidade de Duisburg-Essen. O primeiro passo é coletar amostras de sangue para o isolamento do DNA do poliomavírus.
Colete pelo menos três mililitros de sangue nos tubos de aquisição da EDTA. Centrifugar a amostra a 2.500 G por 15 minutos e pipeta o plasma em um novo tubo. Prepare 40 microliters de proteína SK em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e adicione 400 microliters plasma por pipetação.
Isole o DNA usando um kit de extração de manchas de DNA, conforme descrito nas instruções do fabricante. Prepare a mistura mestre para o pré-PCR usando o par de primer A em um volume total de 50 microliters e use o DNA anteriormente isolado. Distribua 45 microliters da mistura mestre nos tubos PCR.
Adicione cinco microliters do DNA isolado nos tubos PCR e execute o PCR com as condições de reação como ilustrado na tabela três. Repita a desnaturação e a extensão em 35 ciclos. Para aplicação aninhada, use o par de primer B, abrigando os locais de restrição para clonagem.
Misture 10 microliters do produto PCR com dois microliters de corante de carregamento de gel de seis dobras. Carregue 10 microliters da mistura em um gel de 1,5% de agarose e execute o gel por 30 minutos a 60 miliampere. Visualize o gel usando um sistema de documentação UV apropriado.
Purifique os amplicons pcr usando um kit de purificação pcr de acordo com as instruções do fabricante. Digerir os amplicons purificados com as enzimas de restrição de indicadores por duas horas a 37 graus Celsius. Repita as etapas de purificação para purificar os amplicons digeridos.
Em paralelo, também digerir a espinha dorsal plasmida. Analise a espinha dorsal plasmida digerida em um gel de 0,8% de montagem baixa. Não execute o gel a uma corrente superior a 40 miliampere.
Visualize fragmentos de DNA usando luz UV de ondas longas e corte a espinha dorsal dobrada usando um bisturi limpo. Evite longos tempos de exposição uv para evitar danos ao DNA. Cerca para o pedaço de fragmento de gel flomel em um novo tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitro.
Aqueça a espinha dorsal contendo peça de agarose de modo baixo por 10 minutos a 65 graus Celsius, a fim de derreter a peça de gel e misturar a cada dois minutos por vórtice suave. O gel derretido pode ser usado diretamente para ligadura. Espinha dorsal ligate e amplicon digerido usando ligase de DNA T4 durante a noite a 16 graus Celsius.
Após o procedimento padrão de clonagem, isole o DNA de plasma. Realize a digestão da enzima de restrição para verificar se há clones positivos e visualizar fragmentos digeridos em um gel de 1% de agarose. Semente 100.000 células HEK293T por poço da placa de 12 poços 24 horas antes da transfecção e incubar durante a noite a 37 graus Celsius, manter a proliferação ativa durante a transfecção.
As células devem estar aproximadamente em 80% de confluência na transfecção. Coloque 250 microliters de mídia súmada reduzida em tubos estéreis e adicione um micrograma de cada DNA de plasma relatado e misture suavemente por pipetação. Adicione três microliters do reagente de transfecção à mistura de DNA e misture suavemente por pipetação e incubar por 15 minutos a 22 graus Celsius.
Adicione a mistura, em termos de gota ao poço e distribua suavemente para o poço. Após quatro horas, substitua o supernascido por um meio fresco contendo os agentes de teste e o controle de solventes. Neste exemplo, foram utilizados os inibidores mTOR INK-128 e rapamicina.
Incubar a 37 graus Celsius até a análise. Verifique as células quanto à fluorescência vermelha e verde sob o microscópio de fluorescência. Fluorescência vermelha e verde correspondem à expressão genética BK-polyomavírus precoce e tardia, respectivamente.
72 horas após a transfecção, aspira cuidadosamente o supernante. Lave as células duas vezes com um mililitro de PBS frio. Adicione suavemente 500 microliters trypsin e gire a placa ligeiramente para evitar o descolamento prematuro das células.
Este passo é importante para evitar dobras celulares. Após a adição, a trippsina é removida diretamente com a mesma ponta de pipeta. Incubar as células por pelo menos cinco minutos a 37 graus Celsius.
Re-suspender as células trypsin S com um PBS mililitro contendo 3% DE FCS e transferir a suspensão em tubos FACS pré-rotulados. Adicione DAPI a uma concentração de um micrograma por mililitro antes da análise FACS. Analise as células usando um citômetro de fluxo.
Para cada amostra, meça pelo menos 10.000 células vivas. A compensação inicial é essencial para distinguir sinais vermelhos e verdes para alcançar resultados precisos. O regente de controle de não codificação foi amplificado usando um protocolo PCR aninhado usando o par de primer interno que abriga os locais de restrição para clonagem.
A verificação de amplicon foi realizada através de eletroforese de gel agarose Enquanto os amplicons derivados de sequências arquetípicas de NCCR em uma distribuição de tamanho homogêneo no gel, aqueles derivados de NCCRs reorganizados com inserções e exclusões, diferem em seu tamanho. A seleção de clones positivos contendo o NCCR foi verificada por análise de restrição. A pequena região espaçadora foi substituída pelos fragmentos maiores do NCCR indicando clones positivos.
DNA plasmídeo isolado de clones verificados foram enviados para pyrosequencing. Neste exemplo, foi detectada a exclusão no bloco P e a substituição no bloco O. As células HEK293T foram transitoriamente transfeminadas com o respeito pela construção reportável e a atividade nccr foi monitorada por uma microscopia de fluorescência.
Fluorescentes vermelhos e verdes corresponderam à expressão genética BK-polyomavirus precoce e tardia, respectivamente. O primeiro NCCR exibiu uma forte expressão genética tardia, enquanto o segundo exemplo tinha uma expressão genética relativamente forte no início, mas moderada. As células negativas da DAPI foram fechadas e uma parcela de ponto foi criada mostrando eGFP versus tdTomato.
Foram incluídas na análise amostras negativas, bem como as positivas para tdTomato ou eGFP. Intensidades médias de fluorescência foram derivadas de cada clone de teste. Neste exemplo, o tratamento com o inibidor dual mTOR INK128 reduziu significativamente o TdTomato MFI, o que significa que a expressão precoce foi inibida.
Este método permite identificar atualmente usado e outros compostos para detectar o BK-poliomavírus através da atividade transcricional. Na expressão genética primitiva, isso determina decididamente a implicação viral. As gotas inibitórias podem ser consideradas como agentes para os pacientes imunocomprometidos no caso da reativação BK-poliomavírus.
